[發明專利]用于肝細胞分離實驗的灌流液灌注方法

在審

• 申請號: 201710413738.4
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN108048389A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 李陽;高毅;潘明新;彭青;徐小平;蔣澤生;程遠;張斌斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜;王增鑫

本發明公開了用于肝細胞分離實驗的灌流液灌注方法，其包括：在肝組織塊的表面選出多個穿刺區，每個所述穿刺區內選取至少三個穿刺點用于灌注灌流液；在所述穿刺點的位置將注射器的注射口刺入所述肝組織塊，并勻速灌注前灌流液，直至所述肝組織塊由暗紅色逐漸變為灰白色且流出的前灌流液變清亮；再用注射器在所述穿刺區刺入所述肝組織塊，并勻速灌流后灌流液，直至所述肝組織塊變疏松、失去彈性，且表面呈龜背狀裂隙；停止灌流，至此灌注完成。本發明提供的灌流液灌注方法，通過在肝組織塊表面選取多個穿刺區上灌注灌流液，一方面其操作簡單，另一方面，還使肝細胞分離實驗不再受肝組織塊大小和肝組織塊內的血管完整度的限制。

【技術領域】

本發明涉及細胞分離培養領域，尤其涉及一種用于肝細胞分離實驗的灌流液灌注方法。

【背景技術】

以培養肝細胞為生物成分的生物人工肝成為治療急性肝衰竭的有效手段。隨著該研究的深入，迫切需要理想的肝細胞來源與分離、培養技術，尤其是人原代肝細胞。

目前，肝細胞的分離多采用離體兩步膠原酶灌注法，并且通常是從肝臟的門靜脈灌入灌流液，灌注結束后剪短下腔靜脈，使灌流液從下腔靜脈流出，或是通過殘存在肝組織塊中的小血管進行灌流分離肝細胞，使這種方法的應用需要的肝組織塊較大。但人肝組織塊的獲取途徑較少，血管保留較完整的肝組織塊很難獲取，人肝組織塊通常是在手術中切除病變的周圍正常肝組織而獲得，所能獲取的肝組織塊較小，且形狀極不規則，很難找到可供灌流的血管，即便找到，其灌流效果也很不理想。

【發明內容】

本發明為解決上述問題，提供便于對尺寸較小的肝組織塊進行灌流的灌流液灌注方法。

為實現該目的，本發明采用如下技術方案：

用于肝細胞分離實驗的灌流液灌注方法，其包括：

在肝組織塊的表面選出多個穿刺區，每個所述穿刺區內選取至少三個穿刺點用于灌注灌流液；

在所述穿刺點的位置將注射器的注射口刺入所述肝組織塊，并勻速灌注前灌流液，直至所述肝組織塊由暗紅色逐漸變為灰白色且流出的前灌流液變清亮，以去除所述肝組織塊的血竇內的血細胞及非實質細胞；

再用注射器在所述穿刺區刺入所述肝組織塊，并勻速灌流后灌流液，直至所述肝組織塊變疏松、失去彈性，且表面呈龜背狀裂隙；

停止灌流，至此灌注完成。

進一步的，所述穿刺區選取在所述肝組織塊上帶有包膜的包膜區。

可選的，所述穿刺區均勻的分布于所述肝組織塊的表面。

具體的，在所述肝組織塊的表面選出多個穿刺區之前，還包括：用清洗液清洗待灌流的肝組織塊表面的血污。

進一步的，同一所述穿刺區內的多個所述穿刺點以不同的深度刺入所述肝組織塊。

可選的，所述前灌流液的灌流速度為20ml/min。

具體的，所述肝組織塊放置于恒溫環境中，以保持所述前灌流液和所述后灌流液灌流過程中的溫度恒定。

優選的，其特征在于，所述清洗液為D-Hank’s液。

可選的，所述前灌流液為預熱的無鈣平衡鹽溶液。

可選的，所述后灌流液為預熱的Ⅱ型膠原酶溶液。

與現有技術相比，本發明通過在肝組織塊的表面選取多個穿刺區，并灌注灌流液的方式對肝組織塊進行灌流，解除了肝組織塊的大小和肝組織塊內的血管完整度對肝細胞分離實驗中灌注灌流液的限制。

在進一步優化的技術方案中，在同一穿刺區內選取至少三個穿刺點，并分別灌注灌流液，使灌流液具有多個灌流起點，從而使灌流液通過不同的毛細血管和細胞間隙路徑灌流肝組織塊，保證灌流效果。