[發明專利]一種降低最低檢出限檢測牛奶中β?內酰胺酶殘留的方法

在審

• 申請號: 201710413671.4
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107247115A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 張俊杰;李濱;徐潔;張磊;李兵;段蕊
• 申請（專利權）人: 淮海工學院;連云港市新希望乳業有限公司
• 主分類號: G01N31/16
• 分類號: G01N31/16
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司32224
• 代理人: 何文豪

技術領域

本發明公開了一種生物檢測領域，尤其是一種降低最低檢出限檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的方法。

背景技術

β-內酰胺酶，英文名β-Lactamase，由革蘭氏陽性菌代謝產生的一種酶蛋白，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內酰胺類抗生素，其原理是青霉素內酰胺結構被β-內酰胺酶破壞而失去活性，如青霉素和頭孢菌素等。牛奶中的β-內酰胺酶的可能來源有兩種，第一種是外源性，某些奶農或廠家為了殺滅細菌防止新鮮牛奶腐敗，人為直接添加青霉素殺菌后解抗添加進牛奶中的。第二種是內源性，某些奶農為給奶牛治療某些疾病采用注射廉價的青霉素類抗生素或在飼料中中添加青霉素，引起奶牛擠出的牛奶中青霉素殘留或β-內酰胺酶殘留。目前常規方法無法正確判斷是否為“無抗奶”，掩蓋解抗劑即β-內酰胺酶從而掩蓋了青霉素等抗生素超標的事實。β-內酰胺酶無論是在國外還是在我國都是不允許使用的食品添加劑。到目前為止，國內外對β-內酰胺酶各方面的研究是比較少的，甚至連溫度對β-內酰胺酶活性的影響程度都不確定，更糟糕的也未見是β-內酰胺酶及其代謝產物的食用安全性報道。

為了實現對市售牛奶中抗生素殘留的檢測，本發明提出了一種在PH計檢測法的基礎上加入酸堿滴定法進行檢測，此方法提出的一種新型β-內酰胺酶檢測方法是最適合目前我國市場需求的快速，經濟，精確的檢測方法。

發明內容

為了實現對市售牛奶β-內酰胺酶殘留的檢測，同時也為解決目前我國缺少經濟，精確，快速的β-內酰胺酶殘留檢測的問題，達到讓消費者放心的目的，本發明提出了一種在PH計檢測法的基礎上加入酸堿滴定法使其最終最低檢出限大大降低的檢測方法，其技術方案如下：

一種降低最低檢出限檢測牛奶中β-內酰胺酶殘留的方法，其特征在于：利用pH計法做單因素試驗確定酶最適反應溫度、酶反應最適底物濃度、酶反應最適反應時間，再進行酸堿滴定法檢測樣品中β-內酰胺酶含量，并檢測出最低檢出限。

進一步的，所述酸堿滴定法具體包括如下步驟：

(1)用無抗奶粉和50℃-100℃溫水以1：6至1:10的比例配置成牛奶，冷卻至室溫后分別裝入五組錐形瓶，每組5-10ml；

(2)向步驟(1)中的錐形瓶中分別加入濃度為0.01-1g/ml的青霉素儲備液和濃度為1-10U/μl的β-內酰胺酶儲備液，震蕩均勻；

(3)將步驟(2)中的錐形瓶以保鮮膜封口并置于酶最適反應溫度水浴鍋中水浴，水浴完成后以沸水浴滅菌5-20s；

(4)滅菌后向錐形瓶中加入指示劑，震蕩均勻并觀察顏色變化，以NaOH進行滴定，記錄滴定數據；

(5)根據滴定數據計算產酸速度和酶濃度。

進一步的，所述步驟(4)滴定時NaOH濃度為0.001-0.005mol/L或0.010-0.015mol/L，滴定量為8ml—12ml。

進一步的，所述步驟收(3)中指示劑為甲基紅指示劑，用量為1-10滴。

進一步的，所述步驟(2)中五組錐形瓶中β-內酰胺酶儲備液用量為0μl、3μl、4μl、5μl、6μl。

本發明與現有技術相比，有如下優點：

本發明利用PH計，進行單因素試驗，主要測定反應溫度、青霉素鉀底物濃度、反應時間對于整體反應的影響，并繪制標準曲線，以確定最適反應條件。以最適條件為前提進行不同β-內酰胺酶濃度實驗，根據牛奶中所含酸量選用不同濃度的NaOH進行滴定，以甲基紅為指示劑，顏色的變化較清晰，靈敏度高，操作簡單，成本低，耗時短。相比于原本的酸度計法，改進了酸度法檢出限較高的問題，大大降低了β-內酰胺酶的最低檢出限，適用于目前我國市售牛奶檢測的現狀。

附圖說明

圖1為牛奶PH值受不同底物濃度影響變化圖。

圖2為牛奶PH值受不同反應溫度影響變化圖。

圖3為牛奶PH值受不同反應時間影響變化圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做詳細說明：

實施例1：

一、pH計法測定牛奶中的最適酶促反應溫度：

準確稱取無抗奶粉6g，和80℃溫水以1：10配制牛奶溶液60ml,分6組,其中包含一組空白對照組，放入離心管中，每組加入β-內酰胺酶2ml,用旋渦混合器充分振蕩，放入溫度分別為25℃、30℃、32.5℃、35℃、37.5℃、40℃不同溫度的水浴鍋中水浴，將青霉素鉀同時加入到空白和試驗管中，振蕩均勻，立即用實驗室pH計測量，三次測量pH值計算取平均值，具體參數值如下表所示：