[發(fā)明專利]組織模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710412417.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN107058220A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁麗金;陳琦;楊習(xí)鋒;曾晨光
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州新誠生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;C12N5/074;C12Q1/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11371
• 代理人: 劉書芝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種組織模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

現(xiàn)行去細(xì)胞基質(zhì)的制備方法容易導(dǎo)致基質(zhì)成分和三維結(jié)構(gòu)容易被破壞，而且試劑殘留嚴(yán)重，植入組織中可能引起嚴(yán)重的免疫排異反應(yīng)。

現(xiàn)行組織去細(xì)胞基質(zhì)制備工藝，如CN201310376619.8所述的方法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間才能讓化學(xué)去垢劑滲透至組織內(nèi)部，作用于細(xì)胞，除去組織中的細(xì)胞成分。

與此同時(shí),現(xiàn)行新藥研發(fā)流程中大量的時(shí)間和費(fèi)用都花費(fèi)于藥物的檢測和篩選中,構(gòu)建體外組織模型對(duì)于藥物的檢測和篩選,以及藥物的作用機(jī)理和治療效果的研究具有重要意義。

現(xiàn)行共培養(yǎng)組織模型，如CN201310008125.4中介紹的二維培養(yǎng)模型，不能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)三維環(huán)境，限制了模型在藥物檢測和篩選中的應(yīng)用。

現(xiàn)行三維共培養(yǎng)組織模型，如CN201610830529.5中介紹的模型不包含天然生物組織的微脈管系統(tǒng)和生物因子等微環(huán)境，限制了模型在藥物檢測篩選中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種組織模型的構(gòu)建方法，該方法中用于與動(dòng)物細(xì)胞體外共培養(yǎng)的天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)中含有微脈管系統(tǒng)和生物因子等微環(huán)境，使得本發(fā)明方法得到的組織模型與其他共培養(yǎng)模型相比更接近人體組織。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供通過本發(fā)明方法得到的組織模型的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種組織模型的構(gòu)建方法，包括將天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)與動(dòng)物細(xì)胞體外共培養(yǎng)得到所述組織模型。

優(yōu)選地，所述天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)通過預(yù)處理，消毒，脫脂，酶處理，去細(xì)胞，漂洗和滅菌步驟制得；制得的天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)含有微脈管系統(tǒng)和生物因子微環(huán)境；

所述脫脂步驟為將所述天然軟組織置于脫脂劑中2-12h；所述脫脂劑選自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一種或多種；所述脫脂劑的用量為所述組織體積的1-30倍；

所述酶處理步驟為將所述天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中；所述天然軟組織置于含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中的時(shí)間為1-48h；所述生物酶選自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；所述生物酶的濃度為0.1-10wt％；

所述去細(xì)胞步驟為將所述天然軟組織置于含有化學(xué)去垢劑的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液中。

優(yōu)選地，所述天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織；所述動(dòng)物細(xì)胞包括全能干細(xì)胞，多能干細(xì)胞，專能干細(xì)胞，免疫細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨來源細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝來源的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，肝巨噬細(xì)胞，星狀細(xì)胞，上皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，血管細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。

優(yōu)選地，該方法具體包括：

a.取滅菌后的天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)置于培養(yǎng)皿中；

b.將含有動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸濁液注入培養(yǎng)皿中；

c.將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中3-6小時(shí)后，繼續(xù)添加培養(yǎng)基；

d.將動(dòng)物細(xì)胞與天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)3-30天得到所述細(xì)胞組織模型，培養(yǎng)期間每48小時(shí)將培養(yǎng)基完全更換一次。

優(yōu)選地，步驟a中所述培養(yǎng)皿為24孔板；所述培養(yǎng)皿中預(yù)先涂覆纖維連接蛋白；所述天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的厚度為0.05-2mm。

優(yōu)選地，所述步驟b中，所述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸濁液中動(dòng)物細(xì)胞的濃度為20000-500000個(gè)/mL；注入培養(yǎng)皿中的所述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸濁液的液面高度不小于所述天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的厚度。

優(yōu)選地，注入培養(yǎng)皿中的所述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸濁液的液面高度等于所述天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)的厚度。

優(yōu)選地，步驟c中繼續(xù)添加的培養(yǎng)基的體積為步驟b中所述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基懸濁液體積的1-10倍。

上述的模型構(gòu)建方法構(gòu)建的組織模型為天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)與動(dòng)物細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型。

將上述的組織模型應(yīng)用在檢測藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，吸收，和代謝中或檢測藥物功效和篩選藥物中。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明中的天然軟組織去細(xì)胞基質(zhì)作為細(xì)胞培養(yǎng)支架，含有微脈管系統(tǒng)和生物因子等微環(huán)境,有助于細(xì)胞培養(yǎng)支架在再細(xì)胞化過程中細(xì)胞獲取氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，以及細(xì)胞的增殖、遷移和分化。