[發明專利]一種快速檢測腦組織EETs的新方法

有效

• 申請號: 201710411759.2
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107132293B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 朱心紅;王夢瑤;熊文超;朱旻楨;張燕
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

本發明公開了一種快速檢測腦組織EETs的新方法。本發明使用樣品萃取溶劑對腦組織EETs進行快速檢測，樣品萃取溶劑包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12?EET?d¹¹。本發明快速檢測腦組織EETs的新方法在沉淀蛋白法的基礎上，優化了前處理過程，具有快速高效、操作簡單、重復性好等優點，對神經精神疾病等醫學研究具有重要意義。

技術領域

本發明屬生物檢測技術領域，更具體地說，本發明涉及一種快速高效的檢測生物樣本中EETs的新方法。

背景技術

腦內富含脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)；主要有三種：分別花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenic acid,EPA)。ARA是細胞膜的重要組成部分，也是類花生四烯酸的主要前體；細胞膜上的ARA與磷脂結合，簡稱脂化(Esterified)。當膜受體與配體結合后，激活磷脂酶A2(PLA2)，引起ARA脫脂化而形成游離的ARA；在多種代謝酶的作用下，游離的ARA生成具有多種生物活性的類花生四烯酸(Eicosanoids)。

花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)的代謝產物具有廣泛的生理功能，其信號通路在很多神經性疾病中發生改變，如疼痛、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)、抑郁癥等。但生物樣品的成分復雜、基質干擾大，并且環氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，EETs)在血漿和腦組織中極其不穩定。因此，建立高效、靈敏的生物樣品ARA代謝產物分析方法對于很多神經性疾病的精準診斷和治療具有重要的科學意義。

ARA代謝主要有三條途徑：環加氧酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細胞色素P450(CYP)途徑。類花生四烯酸與炎癥有密切關系，因此，ARA-COX、ARA-LOX代謝途徑的酶、受體以及代謝產物等作為靶點被廣泛用于抗炎藥物的研發，包括各種COX抑制劑、LOX抑制劑等。CYP途徑分為：ω-水解途徑(ω-hydroxylases)和環氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，EETs)生成途徑(后者簡稱ARA-EETs代謝途徑)(請參見圖1)。對ARA-EETs代謝途徑的研究始于1980年，直到1996年發現EETs是一類內皮細胞源性的血管舒張因子后，對ARA-EETs代謝途徑的研究才引起學界的廣泛興趣。

ARA在CYP2J/C的作用下生成EETs；環氧化物水解酶(sEH)將一個水分子插入EETs的環氧基團，生成相應的、低活性的二羥基二十碳三烯酸(DHET)。EETs有四個異構體：5,6-、8,9-、11,12-、14,15-EET；EETs具有多種相似的生物活性，如抗炎、抗血小板聚集、舒張血管、促進血液干細胞移植體的生長等等，但四個異構體存在組織分布、生物學特性的個體差異。

提高生物樣本中ARA代謝產物的檢測精準性，可從采用精準的檢測儀器和改變樣品的前處理程序兩方面著手；在相同實驗設備的條件下，完善樣品的前處理方法可以提高生物樣本中ARA代謝產物的檢測精準性。國內外最常見的生物樣品前處理方法有以下幾種，它們各自的優缺點如下：

1、沉淀蛋白法：通過沉淀蛋白質可以將待測的化合物釋放出來，起到提取和純化待測物的目的，可用于測定化合物的濃度。其優點是操作簡便易行、效率高、省時省力、節約成本，目標物回收率較高，可以減少樣品的乳化現象，另外還可以保護儀器，延長使用命。缺點：與液液萃取相比，該法僅除去了蛋白質，內源性雜質并沒有除去；且運用該方法處理后的樣品，目標物會被稀釋，濃度降低，對儀器的靈敏度要求更高；另外，此法所得樣品不能用光譜法檢測。