[發明專利]一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法及其應用與試劑盒

有效

• 申請號: 201710410732.1
• 申請日: 2017-06-04
• 公開（公告）號: CN107219359B
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 石強
• 申請（專利權）人: 石強
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京市盈科律師事務所 11344
• 代理人: 程新霞

1.一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括陽性對照血清、陰性對照血清、陽性標準品、空白試劑、再構細胞板、培養液、漢氏磷酸緩沖液、羊血清/磷酸緩沖液、聚甲醛、羊抗ICAM-1抗體、抗羊FITC標記抗體、白蛋白溶液；其中，所述的陽性標準品、培養液、羊血清/磷酸緩沖液、聚甲醛、白蛋白溶液的組分及配比如下：

陽性標準品：0.1ng/mL腫瘤壞死因子－A；

培養液：EGM-2培養液，EGM-2培養液內含HAM’氏12培基、生長因子添加物；

羊血清/磷酸緩沖液：體積比10％；

聚甲醛：體積比4％；

白蛋白溶液：重量比1％；

所述方法的步驟如下：

(1)依據病人血樣中要鑒定DSA的分型，在細胞庫內選擇表達與DSA類型相對應的人類白細胞組織相容抗原的血管內皮細胞；

(2)將所述血管內皮細胞種植在96-孔細胞培養微孔板的底部，每孔含3000-4000活細胞，所述種植活細胞的微孔板定義為再構細胞板；

(3)向測試的每孔內加入病人血清，在一定條件下孵育一段時間；

(4)收集再構細胞板孔內的上清液，測定血管內皮細胞與血清反應后釋放的生物活性細胞因子；

(5)用體積比4％聚甲醛固定種植在再構細胞板的底部血管內皮細胞，采用免疫熒光組化的方法分析細胞表面粘附分子；

(6)準備試劑盒；

(7)參考試劑盒內提供的陽性與陰性對照血清數值，用于確定病人血清與血管內皮細胞的反應幅度。

2.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：使用了與供者的人類白細胞組織相容抗原表達相同的血管內皮細胞培養物，血管內皮細胞培養物與病人血清的相互作用是特異的。

3.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：所述再構細胞板的細胞為高度選擇性血管內皮細胞；當醫師申請使用此診斷試劑的同時，應提交已植入病人體內供者器官的人類白細胞組織相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP；依據此抗原分型譜在細胞庫內提取、復蘇、種植表達這些抗原的細胞于96-孔細胞培養微孔板的底部；所述試劑盒內的再構細胞板的設計是依據供者的人類白細胞組織相容抗原的類型而為受者制定的，因而有高度的選擇性。

4.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：血管內皮細胞表達的人類白細胞組織相容抗原與接受器官移植的病人DSA抗體相對應。

5.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：所述方法步驟(3)中所述條件為攝氏溫度35℃－37℃、二氧化碳分壓為4％－5％。

6.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：所述方法步驟(3)中所述病人血清和血管內皮細胞的反應時間是24小時。

7.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：人類白細胞組織相容抗原的測定使用低分辨分型方法。

8.根據權利要求1所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異方法的試劑盒，其特征在于：所述血管內皮細胞來自人的新鮮標本，為血管片段、脂肪、肌肉、皮膚、臍帶、肝、肺、腎中的一種。