[發明專利]高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用

有效

• 申請號: 201710408440.4
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107151676B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 裴得勝;謝少林
• 申請（專利權）人: 中國科學院重慶綠色智能技術研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

本發明提供一種高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用，該制作方法包括如下步驟：1）獲取響應啟動子：提供能被POPs誘導表達的基因的啟動子序列，設計引物，擴增得到對持續有機污染物有響應的啟動子，即響應啟動子；2）載體構建：將步驟1）獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體還包括熒光蛋白序列；3）注射培養：將I?SceI核酸酶與步驟2）獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得能夠監測水體中POPs的轉熒光蛋白基因魚。本發明提供了一種方便快捷的生物監測手段，對實現POPs實時監測有重要的推動作用。

技術領域

本發明涉及基因工程與環境科學領域，特別是涉及一種高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用。

背景技術

生物監測是指從生物學角度評價環境質量狀況的過程，通過觀測生物個體、種群或群落對環境質量及其變化所產生的反應和影響，進而闡明其所處環境污染的性質、程度和范圍，包括生物種群及群落調查、急性慢性毒性試驗、水體微生物測試和魚類組織污染物分析。德國是最早開展生物監測的國家，早在20世紀初，已經開展利用水生生物監測水質的工作，時至今日，歐盟、美國等發達國家均已建立了相對比較完備的環境生物監測體系。中國起步相對較晚，1993年隨著《水生生物監測手冊》的出版，初次建立了國家水生生物監測網，開始在全國范圍內開展水生生物監測工作。直至21世紀初，生物監測工作才再次得到重視。

目前傳統的生物監測方法，耗時費力，且不能用于直觀監測。2001年，Mattingly等證實人的cyp1a1啟動子在TCDD的誘導下在48hpf前胚胎中可以觀察到GFP的局部表達，但不能用于活體直觀監測。2004年，Nebert等公布了利用LUC轉基因斑馬魚監測芳香烴類POPs的專利(專利號：US20040147030)，但是該技術所使用的斑馬魚所轉基因為LUC，檢測持續性有機物靈敏度低，同時也不能解決外源基因在受體魚中的整合、表達和遺傳問題；此外，檢測LUC基因表達需要特殊儀器。因而，他們所研制的轉LUC基因斑馬魚一直未能在環境有毒污染物的監測中得到實際應用。Ng GHB(2013)制作了轉綠色熒光蛋白青鳉以及Kun-Hee Kima(2013)制作了轉綠色熒光蛋白斑馬魚，這個綠色熒光蛋白前帶有可以誘導的cyp1a啟動子，在進行TCDD暴露后青鳉和斑馬魚熒光表達均有不同程度的增強，但是這些轉基因魚只在實驗室內進行毒物的檢測，并沒有將其應用到環境監測中來，并且綠色熒光在顯微鏡觀察下腹部具有明顯的背景值，不便于觀察。因此構建熒光蛋白斑馬魚并在環境中進行有效應用是當前急需解決的問題。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用，用于解決現有技術中監測環境中有毒物質時靈敏度低、不便于觀察等問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的培養方法，包括如下步驟：

1)獲取響應啟動子：提供能被POPs誘導表達的基因的啟動子序列，設計引物，擴增得到對持續有機污染物有響應的啟動子，即響應啟動子；

2)載體構建：將步驟1)獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體還包括熒光蛋白序列；

3)注射培養：將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得能夠監測水體中POPs的轉熒光蛋白基因魚。

進一步地，步驟1)中，被POPs誘導表達的基因選自cyp1a基因。

進一步地，步驟1)中，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如SEQ ID NO.1所示的序列。

進一步地，步驟3)中，所述魚選自斑馬魚，當然，其他魚類也可適用。根據魚的種類擴增其cyp1a啟動子序列。