[發明專利]高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用

有效

• 申請號: 201710408440.4
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107151676B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 裴得勝;謝少林
• 申請（專利權）人: 中國科學院重慶綠色智能技術研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

1.一種高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)獲取響應啟動子：提取并純化魚的基因組DNA，通過巢式PCR獲得響應啟動子，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子的序列如SEQ ID NO.1所示；

2)載體構建：將步驟1)獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉移系統，所述響應載體還包括熒光蛋白序列，所述熒光蛋白選自mCherry；采用轉染試劑將響應載體瞬時轉染至細胞中，污染物暴露，篩選得到對POPs有響應效果的響應載體，轉入下一步進行注射；

3)注射培養：將I-SceI酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得能夠監測水體中POPs的轉熒光蛋白基因魚，所述轉熒光蛋白基因魚為轉紅色熒光蛋白斑馬魚。

2.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于：步驟3)中，所述魚選自斑馬魚；

和/或，所述POPs選自TCDD、PAHs中的至少一種。

3.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于：步驟1)中，巢式PCR第一輪反應的引物為cyp1a-nested-F和cyp1a-nested-R，cyp1a-nested-F的序列如SEQ ID NO.2所示，cyp1a-nested-R的序列如SEQ ID NO.3所示；

和/或，步驟1)中，巢式PCR第二輪反應的引物為cyp1a-apa1-F和cyp1a-apa1-R，cyp1a-apa1-F的序列如SEQ ID NO.4所示，cyp1a-apa1-R的序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于：

步驟3)中，將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得F₀代魚，篩選獲得對POPs有響應的F₀代魚，將有響應的F₀代魚與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對POPs有響應的F₁代魚，F₁代魚再與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對POPs有響應的F₂代魚，將F₂代魚自交，獲得F₃代魚，從F₃代魚中篩選得到對POPs有響應的純系轉熒光蛋白基因魚。

5.根據權利要求1-4任意一項所述方法培養獲得的轉熒光蛋白基因魚在監測水體POPs中的應用。

6.一種響應載體，其特征在于，所述響應載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉移系統，所述響應載體包括響應啟動子序列以及熒光蛋白序列，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子的序列如SEQ ID NO.1所示；所述熒光蛋白選自mCherry。

7.根據權利要求6所述響應載體用于培養轉熒光蛋白基因魚的用途。