[發明專利]分離純化Salsolinol合成酶的方法

有效

• 申請號: 201710405322.8
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107460183B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 陳薛釵;鄧玉林
• 申請（專利權）人: 北京工業大學;北京理工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

分離純化Salsolinol合成酶的方法，屬于蛋白純化領域。采用高氯酸沉淀法對Salsolinol合成酶的粗酶液進行預處理；將經過高氯酸處理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K₂CO₃，于?80℃放置一段時間如15分鐘后取出，離心，取上清液；對所得上清液進行超濾，至少包括采用截留分子量3kD的超濾管，對超濾后的濾液采用親水色譜(HILIC)的方法進一步分離純化Sal合成酶。采用本發明方程能完全純化Salsolinol合成酶。

技術領域

本發明屬于蛋白純化領域，具體而言，本發明涉及分離純化Salsolinol合成酶的方法。

背景技術

Sal合成酶(Salsolinol synthase)是兒茶酚異喹啉類物質合成代謝過程中的首個關鍵酶，它是一種催化多巴胺(DA)和乙醛(AcH)生成多巴胺能神經毒性物質Salsolinol的酶，直接影響到Sal及其衍生物在體內的代謝過程，是帕金森病的重要內源性致病因子與其致病密切相關。迄今為止，關于Sal合成酶的研究報道甚少，僅有少數研究人員對其性質做了部分研究工作，但其具體性質仍不清楚。目前推測Sal合成酶可能是一種能催化內源性神經毒素生成的新酶，但它尚未獲得分離純化，更無酶活檢測、酶學性質方面的系統研究。

發明內容

Sal合成酶是一種至今為止尚未獲得分離純化的蛋白質，對其酶學性質知之甚少，研究顯示Sal合成酶具有的分子量小、極性較強等特點。基于此，本發明建立一套基于酸沉淀法、超濾法和親水色譜(HILIC)法等技術的專門針對Sal合成酶的分離純化新方法，它具有操作簡便、回收率高等優點。

分離純化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)采用高氯酸沉淀法對Salsolinol合成酶的粗酶液進行預處理；

(2)將步驟(1)經過高氯酸處理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K₂CO₃，于-80℃放置一段時間如15分鐘后取出，離心，取上清液；

(3)對步驟(2)所得上清液進行超濾，至少包括采用截留分子量3kD的超濾管；進一步還包括在采用截留分子量3kD的超濾管之前，采用截留分子量大于3kD如100kD的超濾管進行超濾；

(4)對步驟(3)超濾后的濾液采用親水色譜(HILIC)的方法進一步分離純化Sal合成酶；

進一步優選進行兩次親水色譜(HILIC)分離純化方法；主要采用硅膠、氰基或氨基等色譜柱，采用乙腈水溶液作為流動相或洗脫，乙腈的體積百分含量為50-95％，按照乙腈比例從高到低依次洗脫；

進一步優選，還包括在采用親水色譜(HILIC)的方法進一步分離純化Sal合成酶之后再通過電泳方法進一步分離純化分子量相對更小的Sal合成酶。電泳方法采用Tris-Tricine SDS-PAGE進行分離。

進一步優選，步驟(1)采用高氯酸溶液，高氯酸溶液中還含有偏亞硫酸鈉和EDTA，進一步優選1M高氯酸、10mM偏亞硫酸鈉和10mM EDTA，高氯酸溶液與Salsolinol合成酶的粗酶液的體積比為1:5；

進一步優選步驟(2)中K₂CO₃的摩爾數是步驟(1)中高氯酸的0.5倍；