[發(fā)明專利]一種構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒弱毒株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710404089.1
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107177560B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李明義;孫化露;金紅巖;李思菲;于澤坤;畢云英;劉陽;單學強;欒志舫;馬禮照;李朝陽
• 申請（專利權(quán)）人: 山東信得科技股份有限公司;青島信得藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/85;A61K39/17;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發(fā)明提供一種基因VII型新城疫病毒弱毒株，是將VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變?yōu)樘K氨酸T和異亮氨酸I；同時將F蛋白也進行弱毒性突變構(gòu)建的。本發(fā)明構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導產(chǎn)生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于疫苗病毒株構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒弱毒株。

技術(shù)背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性烈性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)的危害極大，曾經(jīng)被國際獸疫局(OIE)列為A類病。ND于1926年首先被發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞爪哇，同年發(fā)現(xiàn)于英國的紐卡斯爾城，此后迅速向世界各地傳播。目前ND已在世界范圍內(nèi)發(fā)生了四次大流行，并且宿主范圍不斷擴大。

劉秀梵等對1985‐2003年分離自江蘇浙江地區(qū)的29株新城疫病毒進行序列分析，結(jié)果顯示有17株屬于基因VII型，其中10株分離自發(fā)病鵝群。劉華雷等對2005年分離自中國大陸地區(qū)的83株新城疫病毒進行分析顯示，其中64株屬于基因VII型。Lien等對2003‐2006年間分離自臺灣地區(qū)的20株新城疫病毒均為基因VII型。此外同階段中國周邊的韓國和日本流行的NDV也大都為基因VII型。我們對本實驗室近年分離的部分NDV毒株也進行了測序分析，結(jié)果顯示，70％以上的毒株為基因VII型。由此看出，基因VII型新城疫病毒在中國禽群中廣泛流行，是目前的絕對優(yōu)勢基因型。

當前市場上對新城疫病毒的防控主要使用IV系疫苗株Lasota、clone30和II系疫苗株B1等基因II型的毒株，它們雖然可以提供一定的免疫保護，但是不能完全阻止新城疫病毒的傳播、擴散，特別是基因VII型新城疫病毒的流行給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于流行的基因VII型新城疫病毒都是強毒，因此大多數(shù)毒株不適合作為疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。獲得弱毒株是生產(chǎn)疫苗的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒弱毒株，從而能夠構(gòu)建獲得低毒力的基因VII型新城疫病毒弱毒株，并用于制備疫苗。

本發(fā)明提供的VII型新城疫病毒弱毒株，是將VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變?yōu)樘K氨酸T和異亮氨酸I；同時將F蛋白也進行弱毒性突變構(gòu)建的。

上述的VII型新城疫病毒弱毒株，其一種具體操作方法是通過反向遺傳操作方法來構(gòu)建VII型新城疫病毒弱毒株，其包括如下的步驟：

構(gòu)建表達T7RNA聚合酶的細胞系、

所述的細胞系，是將表達T7RNA聚合酶的基因與載體PCI‐neo連接后轉(zhuǎn)染DF1細胞獲得的；

提供基因VII型新城疫病毒NDV拯救過程中需要的輔助重組質(zhì)粒和一個全基因組重組載體，輔助重組質(zhì)粒分別包含NDV的NP蛋白、P蛋白、F蛋白和L蛋白基因；其中P蛋白的237位和240位的氨基酸分別為T和I；

將輔助重組質(zhì)粒和一個全基因組重組載體轉(zhuǎn)入到表達T7RNA聚合酶的細胞系中，培養(yǎng)獲得基因VII型新城疫病毒弱毒株。

本發(fā)明篩選的構(gòu)建的弱毒株，為基因VII型新城疫病毒rSL株，其于2017年3月20日保藏于中國武漢、武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:V201709；

本發(fā)明所構(gòu)建的弱毒株可用于制備滅活疫苗。

本發(fā)明構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導產(chǎn)生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：新城疫F基因片段PCR鑒定圖；

圖2：NDV毒株(WF株、SL株)基于F基因片段的系統(tǒng)發(fā)生樹；