[發明專利]具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法

在審

• 申請號: 201710402650.2
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107099503A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 汪曉敏;袁衛平;張孝兵;周麗英;萬謙
• 申請（專利權）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

技術領域：

本發明涉及具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術：

綜合治療是惡性腫瘤的重要治療原則,除傳統的化療、放療及手術等治療方法外,免疫治療的地位日益增強。自20世紀80年代，科學家發現淋巴因子激活的自體殺傷細胞(Lymphokine Activated Killer,LAK)經大劑量IL-2體外擴增后,可治療惡性腫瘤,由此提出了過繼性免疫細胞治療腫瘤的概念。腫瘤免疫過繼治療中，NK細胞是重要的效應細胞，NK細胞因不需活化即具有細胞毒作用,且抗瘤譜較廣而被廣泛研究,體外實驗證實NK細胞對多種腫瘤細胞具有殺傷作用。然而由于NK細胞的殺傷活性與IL-2的劑量高低、體內活化NK的數量及腫瘤表面MHC-Ⅰ類抗原的表達高低有關,致使NK細胞在臨床應用中的療效不一，NK細胞殺傷活性對于腫瘤細胞的根除至關重要。研究表明,NK細胞表面有抑制性受體及活化性受體,通過調節其受體的表達可影響NK細胞的殺傷活性。因此,如何提高NK細胞的殺傷活性,提高NK細胞對表達MHC-Ⅰ類抗原的腫瘤細胞的識別,成為解決過繼免疫治療效果的關鍵問題。

目前尚未有真正簡單高效的NK細胞擴增方法，這制約著NK細胞的臨床應用。因此，對NK細胞的生物學特性及體外擴增的進一步研究，必將對惡性腫瘤的臨床免疫過繼治療產生巨大的推動作用。NK細胞由于無需抗原預先致敏即可直接殺傷靶細胞,且不具有“MHC限制性”,而腫瘤細胞往往缺乏MHC-Ⅰ類分子的有效表達,故NK細胞是腫瘤免疫治療中的一個重要部分。除了NK細胞獲得性免疫治療,增強NK細胞活性和探索NK細胞介導的間接或直接抗腫瘤免疫聯合治療是未來NK細胞腫瘤免疫治療的研究方向。目前,增強NK細胞活性的策略可以是通過細胞因子、多功能抗體介導NK細胞活性,通過調節抑制性信號和活化性信號傳遞促進NK活化,或通過免疫藥物及基因修飾提高NK細胞功能等。

盡管近年來NK細胞體外大規模擴增取得了較大進展，已有的擴增方案仍然需要進一步優化，并通過大量體內、體外的試驗對新的擴增方案進行評估。與傳統使用IL-2短期培養NK細胞不同，大規模長期擴增NK細胞所需的硬件設施和軟件管理需要符合現行的藥品生產質量規范(Good Manufacturing Practice，GMP)，培養的細胞需要經過嚴格的細菌和真菌水平檢驗，以控制NK細胞產品的安全。在NK細胞應用于腫瘤患者之前，還需要檢測NK細胞受體和殺傷功能的變化。目前NK細胞免疫治療面臨的挑戰還包括：如何增強體外擴增的NK細胞對腫瘤的識別和浸潤，如何提高NK細胞在體內的存活率。我們仍需要進一步研究更新的擴增方案，提高擴增NK細胞的數量和功能，為NK細胞免疫治療清除最終的障礙。

發明內容：

針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供的具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法。

本發明的具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法為：步驟一：配置培養基，每100mL MEM-a培養基加入5mL血漿，加入IL-2 10U/mL，IL-15100U/mL，IL-21 10U/mL，以及SCF 50ng/mL，包被培養瓶，將纖黏蛋白用PBS或生理鹽水稀釋至0.1mg/mL，吸取5mL加入10cm培養皿中，在4℃包被過夜后，將殘留液體吸出，待用；

步驟二：取樣：取5mL-10mL靜脈血或者臍血，活率≥90％，用于制備單個核細胞，取5mL-10mL淋巴細胞分離液，小心轉移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，離心15min，吸取上層液體即血漿層，用于后期細胞培養，小心吸取中間白膜層，即單個核細胞層，轉移至新離心管中；

步驟三：單個核細胞用500U/mL雙抗的PBS，400g離心10min，充分漂洗3遍，接種在0.1mg/mL纖黏蛋白鋪底的10cm培養皿中，將分離獲得的單個核細胞按1.0-2.0×10⁶個/mL的濃度接種于包被過的細胞培養皿中，放置在37℃下，5％的CO₂的飽和濕度的培養箱內培養；

步驟四：第2-6天，觀察培養基顏色并計數，每2-3天補加新鮮培養基，含5％自的體血漿，調整NK細胞密度為1.0-2.0×10⁶個/mL；