[發明專利]具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法

在審

• 申請號: 201710402650.2
• 申請日: 2017-06-01
• 公開（公告）號: CN107099503A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 汪曉敏;袁衛平;張孝兵;周麗英;萬謙
• 申請（專利權）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

1.具有高殺傷力的自然殺傷性細胞高效體外擴增培養方法，其特征在于：具體的培養方法為：步驟一、配置培養基，每100mL MEM-a培養基加入5mL血漿，加入IL-2 10U/mL，IL-15 100U/mL，IL-21 10U/mL，以及SCF 50ng/mL，包被培養瓶，將纖黏蛋白用PBS或生理鹽水稀釋至0.1mg/mL，吸取5mL加入10cm培養皿中，在4℃包被過夜后，將殘留液體吸出，待用；

步驟二、取樣：取5mL-10mL靜脈血或者臍血，活率≥90％，用于制備單個核細胞，取5mL-10mL淋巴細胞分離液，小心轉移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，離心15min，吸取上層液體即血漿層，用于后期細胞培養，小心吸取中間白膜層，即單個核細胞層，轉移至新離心管中；

步驟三、單個核細胞用500U/mL雙抗的PBS，400g離心10min，充分漂洗3遍，接種在0.1mg/mL纖黏蛋白鋪底的10cm培養皿中，將分離獲得的單個核細胞按1.0-2.0×10⁶個/mL的濃度接種于包被過的細胞培養皿中，放置在37℃下，5％的CO₂的飽和濕度的培養箱內培養；

步驟四、第2-6天，觀察培養基顏色并計數，每2-3天補加新鮮培養基，含5％自的體血漿，調整NK細胞密度為1.0-2.0×10⁶個/mL；

步驟五、第7天后，可將自體血漿含量降低1％，根據細胞培養懸液體積選擇擴瓶，T75培養瓶最大體積40mL，T175培養瓶最大體積200mL，利用流式細胞術檢測CD3^-CD56⁺細胞比例，此類細胞為NK細胞；

步驟六、純化NK細胞，每10⁷細胞加入90μL PBS.加入10μL CD56Micro Beads，混勻，4-8℃，15min，此后，加入1-2mL PBS，在1500r/min，4℃離心5min,棄上清，每10⁸細胞用500μL PBS重懸，將LS/MS柱子安裝到磁鐵上，加入3mL PBS，重力作用自然流盡，將細胞液加入到柱子中，用3mL PBS洗脫三次，利用LS/MS柱子活塞，推出結合在磁珠上的細胞，為純化的CD56⁺NK細胞；

步驟七、利用無血清凍存液將純化的CD56⁺NK細胞凍存于液氮中。