[發明專利]一種造血干細胞培養基

在審

• 申請號: 201710400532.8
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107099504A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 羅天恩
• 申請（專利權）人: 東莞市保萊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司44215
• 代理人: 趙超群

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種造血干細胞培養基。

背景技術

造血干細胞是血液系統中的成體干細胞，是一個異質性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能。它是研究歷史最長且最為深入的一類成體干細胞，對研究各類干細胞，包括腫瘤干細胞，具有重要指導意義。由于造血干細胞具有多向分化的潛能，將造血干細胞移植到體內是治療白血病、淋巴瘤等惡性腫瘤、代謝性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等嚴重危害人類健康疾病的有效方法，可以有效的減輕患者的痛苦。但是，由于造血干細胞在體內的數量極少，大大的限制了造血干細胞在臨床中的應用。

骨髓、外周血和臍血是造血干細胞的重要來源。與骨髓和外周血造血干細胞相比，臍帶血造血干細胞更為原始，自我增殖能力最強，且臍帶血具有富含更早期的造血干細胞、采集方便，造血干細胞免疫原性弱、對異源性抗原產生的抗體少、移植過程中不需要嚴格配型、成熟性T 細胞較少、采集和保存容易、無腫瘤細胞污染、對供者無損傷及副作用、CD34⁺CD38- 與CD34+CD33- 的比例較高等優點，因而臍帶血造血干細胞具有極大的臨床應用價值。但是，單份臍血的造血干細胞含量低，在臨床中很難用于正常體重成人患者的移植。因此，造血干細胞在移植前需要進行體外擴增。

目前，造血干細胞的體外增殖途徑主要有兩種，一種是通過基質的灌注進行體外培養，但是，基質含有各種細胞和各種蛋白成分，成分復雜且不明確，對后期造血干細胞的分離造成較大難度，且成本較高，大大限制了在造血干細胞體外擴增的應用；第二種是將造血干細胞接種于造血干細胞培養基進行體外培養。然而，采用現有造血干細胞培養基培養的造血干細胞大多存在活性和增殖能力較差的問題，且造血干細胞易分化。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種造血干細胞培養基，采用該培養基可顯著提高造血干細胞的擴增率和細胞活性，使造血干細胞能長久處于增殖不分化狀態，保持其干細胞特性。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

本發明提供一種造血干細胞培養基，所述造血干細胞培養基包括基礎培養基和添加于基礎培養基中的添加劑，按終濃度計，所述添加劑包括以下含量的組分：FBS 100-200mg/mL、亞硒酸鈉0.02-0.03μmol/mL、卡介菌多糖核酸5-10mg/mL、千金藤素50-100μmol/mL、海藻糖50-100ng/mL、維生素 C40-80ng/mL、第一細胞因子緩釋微囊1.5-2.5mg / mL、第二細胞因子緩釋微囊25-50mg/mL。

本發明將千金藤素添加到造血干細胞培養基中，和卡介菌多糖核酸相合，相對于普通培養基，其能夠顯著提高造血干細胞增殖率，使造血干細胞具有干性強、活性高的特點；維生素C和海藻糖不僅能夠具有抗氧化作用，而且能夠降低造血干細胞的氧分壓，使造血干細胞在增殖的過程中處于低氧環境中，有利于造血干細胞的增殖。

優選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

A、將IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入預先添加有甘露醇和硫酸鋅的水溶液中，攪拌均勻后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的濃度均為1-2wt％，聚乙二醇的濃度為6-10 wt％；

B、將聚羥基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羥基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇的濃度為12-18wt％；

C、將混合物A 加入到混合物B 中，攪拌均勻后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的體積比為1:1-2；

D、將聚乙烯醇、殼聚糖和氯化鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的濃度為1-2 wt %，殼聚糖的濃度為0.5-1 wt %，氯化鈉的濃度為1-2 wt %；

E、將混合物C加入混合物D中，攪拌進行溶劑揮發，經洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得第一細胞因子緩釋微囊。

優選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的粒徑為50-90μm。

優選地，所述聚乙烯醇由質量比為1:0.5-2的無規聚乙烯醇和間規聚乙烯組成。

優選地，所述無規聚乙烯醇的聚合度為600-1000，所述間規聚乙烯的聚合度為1800-2500。

優選地，所述混合物A中，甘露醇的濃度為2-4 wt％，碳酸鋅的濃度為1-3 wt％。

優選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：