[發明專利]一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法

在審

• 申請號: 201710400065.9
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN106990153A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 李科;王桂臻;王迪;秦雪梅
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 雷立康

技術領域

本發明涉及一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，具體屬于熒光輔助凝膠電泳技術，以黃芪多糖部分酸水解后差異性糖片段的含量為鑒定依據的蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別方法。

背景技術

黃芪，古名黃耆，素有“補益之長”的美譽，收載于歷版的《中國藥典》，是豆植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表，利尿托毒，斂瘡生肌等功效，有“十藥九芪”之說，備受歷代中醫的青睞。且以黃芪為原料的中成藥多達200余種國內市場對黃芪的需求極大，其中約有50％用于生產黃芪飲片，近50％用于中成藥和提取物及制劑。

蒙古黃芪和膜莢黃芪因其化學成分有差異而導致其藥效有所不同，雖然在植物地上部分形態特征和生物學特征方面也有明顯區別，但其藥用部分黃芪根外形比較相近，肉眼難以區別。因此，近年來藥材市場上出現了兩種黃芪混雜現象，擾亂了中藥材市場。

臨床研究表明，糖類成分是黃芪發揮免疫調節作用的主要物質。將糖類成分作為黃芪質量控制與品質評價的標準，具有良好的研究前景和意義。國內外學者也嘗試以總多糖含量對不同種屬的黃芪進行比較，然而，所測定的指標缺乏黃芪種屬的專屬性特征，難以用于黃芪種屬的鑒別。

發明內容

本發明的目的是解決現有的蒙古黃芪和膜莢黃芪鑒別方法專屬性低、難以鑒別黃芪種屬的技術問題，提供一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，包括如下步驟：

1)原料預處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細粉，備用；

2)提取粗多糖：取上述黃芪細粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘渣再加水重復提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調節至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；

3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；

4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應結束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產物，然后加入適量甲醇清洗水解產物，繼續氮氣吹干；

5)多糖酸水解產物、三糖標準品和二糖標準品的衍生化：取三糖標準品6mg、二糖標準品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產物，分別加入200μL的NaCNBH3溶液，再分別加入200μL的ANTS衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應15h后，將三種產物用氮氣吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖標準品、二糖標準品及多糖酸水解產物的衍生化樣品，其中三糖標準品和二糖標準品的衍生化樣品用6mol/L的尿素溶液分別稀釋成不少于6個濃度梯度的衍生化樣品；

6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為pH8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上樣量為1-3μL，凝膠在UV300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品的電泳圖；

7)繪制三糖標準品和二糖標準品的標準曲線：將多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品的電泳圖導入Quantity One軟件，經過處理后，得到多糖酸水解產物及三糖標準品和二糖標準品的光密度值，以三糖標準品和二糖標準品的光密度值為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；

8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產物的光密度值帶入步驟7)中的標準曲線，計算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據以下標準鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：

當二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3時，為蒙古黃芪；

當二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3時，為膜莢黃芪。

進一步地，步驟2)中所述黃芪細粉與水的質量比為1:100。