[發明專利]一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法

在審

• 申請號: 201710400065.9
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN106990153A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 李科;王桂臻;王迪;秦雪梅
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 雷立康

1.一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)原料預處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細粉，備用；

2)提取粗多糖：取上述黃芪細粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘渣再加水重復提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調節至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；

3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；

4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應結束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產物，然后加入適量甲醇清洗水解產物，繼續氮氣吹干；

5)多糖酸水解產物、三糖標準品和二糖標準品的衍生化：取三糖標準品6mg、二糖標準品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產物，分別加入200μL的NaCNBH3溶液，再分別加入200μL的ANTS衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應15h后，將三種產物用氮氣吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖標準品、二糖標準品及多糖酸水解產物的衍生化樣品，其中三糖標準品和二糖標準品的衍生化樣品用6mol/L的尿素溶液分別稀釋成不少于6個濃度梯度的衍生化樣品；

6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為pH8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上樣量為1-3μL，凝膠在UV300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品的電泳圖；

7)繪制三糖標準品和二糖標準品的標準曲線：將多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和二糖標準品衍生化樣品的電泳圖導入Quantity One軟件，經過處理后，得到多糖酸水解產物及三糖標準品和二糖標準品的光密度值，以三糖標準品和二糖標準品的光密度值為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；

8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產物的光密度值帶入步驟7)中的標準曲線，計算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據以下標準鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：

當二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3時，為蒙古黃芪；

當二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3時，為膜莢黃芪。

2.根據權利要求1所述的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，其特征在于：步驟2)中所述黃芪細粉與水的質量比為1:100。

3.根據權利要求1所述的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，其特征在于：步驟2)中所述殘渣與水的質量比為1:80。

4.根據權利要求1所述的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，其特征在于：步驟6)中分離膠和濃縮膠的配制溶劑為pH8.0～9.0、濃度0.1～0.2mol/L的Tris-boric緩沖液。

5.根據權利要求1所述的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，其特征在于：步驟6)中的電泳分離過程分兩步進行，首先采用60-80V的分離電壓電泳分離40-60min，隨后采用100-200V的分離電壓電泳分離100-120min。