[發明專利]基于熒光共振能量轉移的AFP檢測法

在審

• 申請號: 201710399835.2
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107238709A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 周勇;吳秀蘭
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了一種基于熒光共振能量轉移的AFP檢測法，屬于納米免疫分析技術領域。

背景技術

熒光共振能量轉移（FRET）是指在兩個不同的熒光基團中，若一個熒光基團（供體Donor）的發射光譜與另一個基團（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于10 nm），即可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象。

量子點（QDs）是直徑約為2~20nm，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒。傳統的FRET研究的主要集中于有機熒光分子數，作為一種新型FRET試劑，QDs具有許多有機熒光分子不具備的優點，如有可調諧的激發波、抗漂白性、多個染料分子同時連接、狹窄的發射波長和遠離發射峰激發等優良的光學性質。因此，QDs可以成為比有機熒光分子更好的FRET的供體或受體。

熒光能量轉移體系發光強度大，靈敏度高，方法簡單。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于熒光共振能量轉移的AFP檢測法，利用熒光配對染料之間熒光共振能量轉移快速均相檢測廣譜腫瘤標記物AFP。該方法可以在均相中實現對AFP的檢測，且對AFP的檢測具有靈敏度高和選擇性好的特點。

本發明采用以下技術方案：

一種基于熒光共振能量轉移的AFP檢測法，包括以下步驟：

一、探針1和探針2的制備

A、CdS的制備

在合成過程保持攪拌狀態的體系中，將0.1 mol/L的CdCl₂溶液2~8 mL注入到100 mL去離子水中，加入0.2~2.0 mmol的巰基乙酸作為修飾劑，2~5min后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節體系pH值至9~11，溶液體系呈無色透明，隨后加入0.5~4 mL濃度為0.1 mol/L的Na₂S水溶液，即得CdS量子點（其激發波長364 nm，發射波長530 nm）。

B、取CdS量子點分別用0.05 M的MES緩沖溶液稀釋后，加入EDC和NHS（QDs: EDC的摩爾比為1:50～1:200；EDC: NHS的摩爾比為1:1～1:5），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60 min；將活化的量子點用30 KD超濾管在8000 r/min，4℃條件下離心10 min，超濾純化后，加入PBS7.4稀釋，加入相對應單克隆AFP抗體溶液（QDs和抗體的摩爾比為1:1～10:1），4℃反應過夜，即得探針1。

C、取熒光物質（羅丹明B或紅色熒光微球）分別用0.05 M的MES緩沖溶液稀釋后，加入EDC和NHS（熒光物質: EDC的質量比為1:50～1:200；EDC:NHS的摩爾比為1:1～1:5），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60 min；將活化的熒光物質用30KD超濾管在8000 r/min，4℃條件下離心10 min，超濾純化后，加入PBS7.4稀釋，加入相對應單克隆AFP抗體溶液（熒光物質和抗體的質量比為100:1～10:1），4℃反應過夜，即得探針2。

其中，羅丹明激發波長525-550nm，發射波長580 nm；紅色熒光微球激發波長520～535 nm，發射波長600 nm。羅丹明B購于sigma；紅色熒光微球購于蘇州為度生物。

二、探針1-AFP-探針2熒光共振能量轉移體系制備

探針1-AFP-探針2熒光共振能量轉移體系為：

樣本（標準品或待測樣本） 2 μL

0.05mg/ml探針1 20 μL

0.05mg/ml探針2 10 μL

PBS7.4緩沖液 50 μL

ddH₂O補足至100ul。

三、AFP工作曲線

先將濃度為0.075～30 ng/mL的不同濃度的標準品樣本分別與探針1、PBS緩沖液接觸混勻后，分別加入探針2，超純水定容到100 μL。然后常溫旋轉30～60 min后，將該體系置于多功能酶標儀上檢測熒光強度。記錄混合液在探針2最大發射波長（580 nm或600 nm處）的熒光強度，存在AFP時F，不存在AFP時F₀，以(F-F₀)對AFP濃度繪制標準曲線。

通過探針1-AFP-探針2熒光共振能量轉移體系檢測待測樣本的熒光信號，將待測樣品的熒光信號值代入AFP標準曲線，得出待測樣品中AFP的含量。