[發明專利]一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710399343.3
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107085110A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 余躍飛;王小中;黃龍
• 申請（專利權）人: 江西樂成生物醫療有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒，其特征在于，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體是L選擇素制得的單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下：

S1：抗原的制備；把L選擇素的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原；

S2：捕獲抗體的制備；將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。

3.根據權利要求1所述的一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體為L選擇素制得的多克隆抗體。

4.根據權利要求3所述的一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下：

S1：抗原的制備；把L選擇素的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原；

S2：檢測抗體的制備；將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。

5.根據權利要求1或2所述的一種用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內。

6.一種根據權利要求5所述的用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：抗原的制備：將L選擇素基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；

S2：捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

S3：檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

S4：捕獲抗體包被：

S4.1：用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為1μg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；

S4.2：封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；

S4.3：棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μlPBST，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4℃環境中；

S5：封閉：每孔添加200μl封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。

7.一種根據權利要求5所述的用于甲狀腺癌體外診斷試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：抗原的制備：將L選擇素基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達；

S2：捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

S3：檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

S4：捕獲抗體包被：

S4.1：用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為1μg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；

S4.2：封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；

S4.3：棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μl PBST，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4℃環境中；

S5：封閉：

S5.1：在微量滴定板的每個孔添加200μl封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；

S5.2：封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

S6：加樣：

S6.1：將100μl樣品添加到每個孔，在37℃孵育60分鐘；

S6.2：棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μl PBST；

S6.3：將100μl濃度為0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個孔；

S6.4：封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

S6.5：用PBST洗滌微量滴定板四次；

S6.6：添加100μl標記二抗；

S6.7：封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

S6.8：用PBST 洗滌微量滴定板四次；

S7：檢測：

S7.1：將TMB溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度；

S7.2：由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸（對數標度）上，而吸光度標在Y軸（線性標度）上。

8.通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。