[發(fā)明專利]腫瘤免疫T細胞檢測試劑盒和檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710396412.5
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107099603A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 唐珂;胡邊
• 申請（專利權(quán)）人: 成都克里斯博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京迎碩知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,錢揚保

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于精準生物醫(yī)學檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及利用定量PCR擴增檢測與腫瘤免疫精準醫(yī)療臨床前和臨床研究相關(guān)的免疫系統(tǒng)特異基因在人體外周血液T細胞中的定量表達譜以及特異PCR引物。

背景技術(shù)

腫瘤免疫治療是應(yīng)用免疫學原理和方法，提高腫瘤細胞的免疫原性，增強機體免疫應(yīng)答，并應(yīng)用體外擴增免疫細胞或效應(yīng)藥物輸注患者體內(nèi)，協(xié)同機體免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長(Kershaw et al.,2013；Barrett et al.,2014；Melero et al.,2015)。上世紀五十年代Burnet和Thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認為機體中經(jīng)常會出現(xiàn)的突變的腫瘤細胞可被免疫系統(tǒng)所識別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)(Burnet,1967)。近年來，腫瘤免疫治療已在部分腫瘤類型如淋巴瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌等的治療中表現(xiàn)出了極佳的抗腫瘤活性，一些腫瘤免疫治療抗體藥物已獲得美國FDA(Food and Drug Administration,FDA)批準臨床應(yīng)用。腫瘤免疫治療由于其突出的療效和創(chuàng)新性，2013年美國《科學》雜志把腫瘤免疫治療選為當年最大的科學突破(Science,2013)，2015年又將腫瘤免疫聯(lián)合治療列為最值得關(guān)注的四項科學進展之一(Travis,2015)。腫瘤免疫治療有望成為繼手術(shù)，化療，放療，靶向治療后腫瘤治療領(lǐng)域的一場革新。然而，免疫細胞對腫瘤細胞的有效識別，以及腫瘤細胞對免疫細胞活性的抑制，是腫瘤免疫治療面臨的挑戰(zhàn)和難題。

CAR—T(嵌合抗原受體T細胞)腫瘤免疫治療技術(shù)：T細胞表面表達激活性受體如：CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM等，這些受體的激活能有效增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。針對免疫細胞特異識別腫瘤細胞有效性，CAR—T(嵌合抗原受體T細胞)療法應(yīng)運而生：即通過精確檢測患者腫瘤細胞特異性，在體外對患者T細胞改造表達對自身腫瘤細胞特異的嵌合抗原受體，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，讓免疫系統(tǒng)高效特異識別并殺傷腫瘤細胞。如：alfaCD19.4-1BB.CD3zeta CARTs已開始用于淋巴瘤的臨床治療探索。

腫瘤免疫檢查點抑制治療技術(shù)：T細胞表面還表達免疫檢查點抑制性受體如：CTLA4、PD1、GITR、TIM3、BTLA、LAG3等，這些受體的活化將抑制T細胞的抗癌功能。針對腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制是通過激活免疫細胞的抑制性受體實現(xiàn)的，以抗體藥物如PD—1(程序性細胞死亡1)抗體藥物為代表的免疫檢查點抑制療法已用成功于多種腫瘤的免疫臨床治療。

免疫治療T細胞檢測試劑盒與檢測方法：無論是CAR—T治療技術(shù)還是免疫檢查點抑制治療技術(shù)的成功實施，需要前期個性化的精準檢測，為治療方法提供精確的靶點。現(xiàn)代生命科學與臨床醫(yī)學的進步，尤其是人基因組測序計劃的完成，以及定量PCR技術(shù)等分子診斷檢測技術(shù)的發(fā)展，為腫瘤的個性化精準檢測與精準醫(yī)療提供了可能。然而，針對目前腫瘤免疫的免疫細胞定量PCR檢測靶點不完善。針對目前腫瘤免疫存在的缺乏對免疫細胞受體和配體、細胞因子等基因表達的有效檢測的問題：(1)在多種免疫細胞中，外周血液T細胞對腫瘤細胞有強的細胞毒性；(2)有多種激活性受體參與T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，而且不同類型的腫瘤對不同的激活性受體有響應(yīng)性；(3)腫瘤細胞可能通過激活T細胞的抑制性受體，從而使T細胞失活，其中不同類型的腫瘤可能活化不同的抑制性受體通路；(4)在免疫治療過程中可能產(chǎn)生不良的細胞因子風暴，要及時對治療過程進行調(diào)整；(5)患相同腫瘤的患者之間有個體差異，需要進行個性化的腫瘤免疫治療和其它診治手段。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種腫瘤免疫T細胞檢測試劑盒以及檢測方法，其能夠高效定量檢測腫瘤免疫治療前、治療過程中與治療后相關(guān)免疫細胞基因。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤免疫T細胞檢測試劑盒，包括基于SYBR-Green定量PCR擴增對人體外周血液T細胞中免疫相關(guān)靶基因進行PCR擴增以檢測其特異定量表達的特異引物(對)，所述免疫相關(guān)靶基因包括受體和配體相關(guān)靶基因、NK細胞相關(guān)靶基因以及關(guān)鍵細胞因子基因，