[發(fā)明專利]血清游離甘露糖和葡萄糖的高效液相色譜檢測

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710394424.4
• 申請日: 2017-05-29
• 公開（公告）號: CN108956792B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 張麗娟;劉永
• 申請（專利權）人: 青島大學附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

基于現(xiàn)有技術中血清游離甘露糖和葡萄糖檢測的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種血清游離甘露糖和葡萄糖HPLC分析方法，將其應用于測定血清中的游離葡萄糖和甘露糖。與其他檢測方法相比，本發(fā)明中樣品的前處理過程更加簡單，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。此外，采用本發(fā)明檢測血清樣品時，甘露糖，鼠李糖和葡萄糖可以完全分離，而且甘露糖與葡萄糖在進行定量時相互之間不會產(chǎn)生影響；從而保證了檢測結(jié)果的準確性。

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及血清中單糖的檢測，尤其涉及血清游離甘露糖和葡萄糖高效液相色譜(HPLC)檢測。

背景技術

人體血清游離單糖中葡萄糖(Glc)的含量最高，正常范圍為3.9～6.16mmol/L，甘露糖 (Man)的含量約為葡萄糖含量的1％。在真核細胞中，由14個單糖組成的寡糖(含9個甘露糖，3個葡萄糖和2個N-乙酰葡糖胺)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)移倒大多數(shù)新合成的蛋白質(zhì)的N-糖鏈連接位點上。在高爾基中9個甘露糖中的6個可以不同程度的被切除，寡糖作為底物形成高甘露糖型、雜化型或復雜性的N-糖鏈，而甘露糖則隨連接有N-糖鏈的糖蛋白在高爾基網(wǎng)中移動，最終被釋放在細胞之外。蛋白質(zhì)的N-糖化機制解釋了甘露糖廣泛存在與動物血清中。研究表明，糖尿病患者血清游離單糖中，除葡萄糖明顯升高外，甘露糖的含量也較正常人為高。研究報道，異常蛋白質(zhì)糖基化不僅與糖尿病相關，也與其他代謝綜合征，包括癌癥和其他復雜疾病有關。因此，測量人血清中的葡萄糖與甘露糖濃度將為遺傳性疾病的治療以及糖尿病和其他蛋白質(zhì)糖基化異常病人的診斷提供新型分子水平信息。

根據(jù)早期的研究報道(2008年以前)，檢測血液中甘露糖的方法包括高效液相法、毛細管電泳法和酶法。Janmes R.ETCHISION等人(Clinical Chemistry 43,No.3,1997,533–538)采用酶法通過配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜分析血清中的游離甘露糖。該方法首先需要通過非常復雜的前處理步驟將高含量的葡萄糖除去，才能對甘露糖進行檢測，血清用量為200μL。Hubert A等人(Clinical Chemistry 47,No.7,2001,1319-1321)采用柱前衍生化方法通過毛細管電泳分析血清中游離甘露糖。該方法分析時間僅為8min，然而同樣需要通過非常復雜的前處理步驟將高含量的葡萄糖除去，才能對甘露糖進行檢測。Tadao Taguchi等人 (Clinical Chemistry 49,No.1,2003，181-183)采用柱后衍生化方法通過高效液相法測定了血漿中游離甘露糖，色譜柱為陰離子交換柱，檢測器為熒光檢測器。該方法的分析時間為57min，需要通過較為復雜的前處理步驟將高含量的葡萄糖除去，才能對甘露糖進行檢測；且采用柱后衍生，因此從對設備要求高。

綜上所述，這些方法的共同特點是需要首先將高含量的葡萄糖除去，才能對甘露糖進行檢測，因此前處理步驟繁瑣，操作過程復雜。在2008年，Sato等人(Research inVeterinary Science 84(2008)26–29)采用對氨基苯甲酸乙酯(ABEE)作為血清單糖的衍生化試劑，高效液相法分離不同單糖，通過紫外檢測器檢測葡萄糖、熒光檢測器檢測甘露糖，從而首次實現(xiàn)了對狗與雞血清中葡萄糖與甘露糖的同時定量分析。該方法血清用量為100μL，需要用兩種檢測器兩種標準曲線分別對葡萄糖與甘露糖進行定量。此方法尚未用于人血清中的葡萄糖與甘露糖定量定性分析。

發(fā)明專利CN 103969371 B公開了“一種血液降解得到并檢測單糖的方法在癌癥檢測中的應用”。該發(fā)明專利首先將血清樣品通過酸降解，將其中的多糖和糖蛋白降解為單糖組分；然后經(jīng)過PMP衍生和高效液相對降解后得到的8種單糖進行檢測。相比降解前的血清，樣品組分與性質(zhì)已經(jīng)發(fā)生巨大變化。因此，該專利所述的方法僅僅適用于降解后血清的檢測，不適用于血清的直接檢測；此外，該方法采用的高效液相色譜的檢測時間長，效率低。受到檢測方法的限制，血清中游離甘露糖的深入研究受到了一定的阻礙。因此，建立高效準確的血清中游離甘露糖的檢測方法，對于研究血清游離單糖與疾病之間的關系、尋找疾病臨床檢測的標志物有著非常重要的意義。