[發(fā)明專利]血清游離甘露糖和葡萄糖的高效液相色譜檢測

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710394424.4
• 申請日: 2017-05-29
• 公開（公告）號: CN108956792B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗娟;劉永
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

1.血清游離甘露糖和葡萄糖的高效液相色譜檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)血清游離單糖衍生：

①取適量血清樣品，向其中依次加入超純水、鼠李糖溶液、氫氧化鈉溶液、1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮溶液，混合后得到pH＝7-14的體系，混合后離心處理，特定溫度下反應(yīng)一定時間，得到樣品A；

②將樣品A冷卻至室溫，加入適量HCl溶液，混合后得到pH＝1-7的體系，離心處理，然后采用三氯甲烷萃取3次，每次取上清液，得到樣品B；

③將樣品B高速離心處理，得到樣品C；

(2)將步驟(1)得到的樣品C采用高效液相色譜進行檢測；檢測方法為外標(biāo)法，同時采用人體中不存在的鼠李糖作為內(nèi)參單糖；

步驟(1)中所述氫氧化鈉和1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮的摩爾比為2:5；所述HCl和氫氧化鈉的摩爾比為1.5:1-2.5:1；

步驟(1)中所述血清的體積為10μL、超純水的體積為20μL、鼠李糖溶液的濃度為0.1mg/ml，鼠李糖溶液的體積為10μL；①中所述的特定溫度為70℃，反應(yīng)時間為1h；③中所述高速離心處理為在13000r/min的速度下離心10min；

所述高效液相色譜為Agilent 1260高效液相系統(tǒng)，Agilent PoroshellEC-C18色譜柱；高效液相色譜條件如下：(1)檢測波長：254nm；參比波長：360nm；(2)流動相：PH＝5 .5的醋酸鹽為鹽相，乙腈作為有機相；梯度洗脫；(3)柱溫：25-50℃；(4)流速：1.0mL/min；(5)進樣體積：20μL；(7)色譜柱沖洗溶劑：含有0.1％的三氟乙酸的水和乙腈沖洗色譜柱。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清游離甘露糖和葡萄糖的高效液相色譜檢測方法，其特征在于：步驟(2)中所述梯度洗脫的梯度模式參數(shù)為：時間梯度：0→10→15→20min；乙腈的濃度梯度：15％→22％→24％→15％；0 .10mol/L PH＝5.5乙酸銨緩沖溶液的濃度梯度：85％→78％→76％→85％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清游離甘露糖和葡萄糖的高效液相色譜檢測方法，其特征在于：所述外標(biāo)法包括以下幾個步驟：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取40μL濃度為0.5、0.25、0.10、0.05、0.025、0.01、0.005、0.0025、0.001、0.0005mg/mL的甘露糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，加入40μL 0.3M 氫氧化鈉溶液，再加入60μL 0.5M PMP溶液，70℃烘箱反應(yīng)1h；取出反應(yīng)物冷卻至室溫，加入80μL 0.3MHCl， CHCl₃ 萃取三次；13000r/min離心10min；然后分別采用高效液相色譜進行檢測分析，以單糖的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)檢測待測樣品：取10μL待測血清樣品，加入20μL超純水，10μL 0.1mg/ml鼠李糖溶液，衍生上樣；利用步驟(1)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測血清樣品中游離甘露糖和葡萄糖的含量。