[發明專利]一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法

有效

• 申請號: 201710393695.8
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107217028B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 車七石
• 申請（專利權）人: 廣州潤虹醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074;C12N5/077;A61L27/60;A61L27/36;A61L27/38
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法，本發明通過尿液細胞轉染誘導產生多能干細胞，繼續誘導產生充質干細胞，由充質干細胞分化形成表皮細胞、成纖維細胞和毛囊細胞，與生物支架材料羊膜構建含有附屬器的組織工程雙層皮膚，本發明制備的組織工程皮膚種子細胞為尿液細胞獲取方便，培養周期短，含有的毛囊結構有利于創面的愈合，并且本發明為后續開發含有附屬器組織工程皮膚奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法。

背景技術

皮膚作為人體最大的組織器官，是人體的第一道防護屏障，它可以防止體內水份、電解質的丟失，同時也保護機體不受外界有害物質的侵害，皮膚容易受到外傷、燒傷、炎癥、潰瘍、腫瘤術后及先天疾病等因素的損害。組織工程皮膚的出現為創面修復領域研究提供了一種新的治療途徑。目前國內外市場已有很多種皮膚替代物，一種只具有真皮層的單層組織工程皮膚，這種皮膚替代物隔離外界細菌能力差，容易引起感染；另一種為雙層組織工程皮膚，既含有表皮層又含有真皮層的組織工程化皮膚，這種皮膚替代物雖然效果較好，但是細胞生長及保存條件苛刻，使其成本高昂，保質期短，而且所用支架膠原凝膠的收縮率較大，使用同種異體細胞和牛膠原，存在著不可預知的免疫排斥反應和潛在病毒感染的風險而且脆性大，操作困難。就對于目前的技術方法并不能在組織工程皮膚中構建出皮膚的附屬器結構，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。這些結構在皮膚創傷修復和重建過程中又起著至關重要的作用。因此，本發明對于含有毛囊附屬器的組織工程皮膚的構建對于后續研發含有附屬器的組織工程皮膚奠定了基礎。

公告號為CN101773688B的中國專利公開了一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，是在凝膠溶液中接種羊膜間充質干細胞、向毛乳頭方向誘導的羊膜間充質干細胞、羊膜上皮細胞、向汗腺上皮方向誘導的羊膜上皮細胞，經真皮層培養后，再經形成毛囊、汗腺結構的誘導培養，于其表面再接種羊膜上皮細胞和經向角質形成細胞誘導的羊膜上皮細胞，培養后得到具有毛囊、汗腺結構的組織工程皮膚，該發明使用的培養基80％體積分數來源于動物細胞外基質，成分復雜，容易傳播疾病，容易發生排斥反應。

公告號為CN105056307A的中國專利公開了一種人造皮膚及其制備方法，該人造皮膚包括表皮細胞、真皮細胞和生物支架材料；其是將所述真皮細胞復合于所述生物支架材料內部，在表面接種所述表皮細胞，培養制備獲得的。該人造皮膚具有真皮層和表皮層，帶有活性細胞，且表皮層中含有角質層，接近于正常皮膚，但是該發明所述的生物支架材料是膠原蛋白、細胞外基質復合物、透明質酸、多糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物中的一種或兩者以上混合物。

發明內容

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法，使用尿液細胞為種子細胞，獲取方便，培養周期短，含有的毛囊結構有利于創面的愈合，并且本發明為后續開發含有附屬器組織工程皮膚奠定了基礎。

本發明技術方案如下所示：

一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，步驟為：

步驟一：尿液細胞的收集

1)收集杯中加入2mL青霉素/鏈霉素雙抗后，收集90-150mL尿液；

2)將尿液倒入3-5個50mL離心管中，離心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液體1-5mL，合并到一個離心管內，加入10-30mL含有體積分數為5％青霉素/鏈霉素的PBS中，混勻后，離心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液體0.5-1ml；

3)將六孔板1孔用0.1％明膠包被20min-30min后，吸去孔內液體，將步驟2)得到的剩余液體倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培養基再加入3μL Primocin后，放入37℃培養箱內培養，待尿液中細胞貼壁后，進行換液處理；

4)當尿液細胞融合度達到80％，則可進行傳代培養；