[發(fā)明專利]一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710393695.8
• 申請(qǐng)日: 2017-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107217028B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車七石
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州潤(rùn)虹醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/074;C12N5/077;A61L27/60;A61L27/36;A61L27/38
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，步驟為：

步驟一：尿液細(xì)胞的收集

1)收集杯中加入2mL青霉素/鏈霉素雙抗后，收集90-150mL尿液；

2)將尿液倒入3-5個(gè)50mL離心管中，離心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液體1-5mL，合并到一個(gè)離心管內(nèi)，加入10-30mL含有體積分?jǐn)?shù)為5％青霉素/鏈霉素的PBS中，混勻后，離心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液體0.5-1ml；

3)將六孔板1孔用0.1％明膠包被20min-30min后，吸去孔內(nèi)液體，將步驟2)得到的剩余液體倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培養(yǎng)基再加入3μLPrimocin后，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待尿液中細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行換液處理；

4)當(dāng)尿液細(xì)胞融合度達(dá)到80％，則可進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟二：多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

①細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28導(dǎo)入尿液細(xì)胞，然后分至預(yù)先用matrigel包被的6孔板中，用培養(yǎng)液B補(bǔ)至每孔2mL培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)密度為1×10⁶/ml；

②細(xì)胞增殖：細(xì)胞轉(zhuǎn)染第2天，將培養(yǎng)基B更換為mTesR1培養(yǎng)基，并且連續(xù)7天每天更換mTesR1培養(yǎng)基，得到克隆細(xì)胞；

③細(xì)胞優(yōu)化：鏡下觀察并挑選形態(tài)與人胚胎干細(xì)胞相近的克隆細(xì)胞，作為多能干細(xì)胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，細(xì)胞接種密度為1×10⁶/ml，每孔加1mLmTesR1培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟三：間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

(1)當(dāng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞長(zhǎng)至80％時(shí)，將mTesR1培養(yǎng)基去除，加1mLDMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，離心5min，收集細(xì)胞沉淀，加入mTesR1培養(yǎng)基以1：3的比例進(jìn)行傳代，傳至已被Matrigel包被好的六孔板中；

(2)待多能干細(xì)胞長(zhǎng)至六孔板的70％-80％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換培養(yǎng)基D，培養(yǎng)2天后，得到間充質(zhì)干細(xì)胞，加含0.5mMEDTA的DPBS進(jìn)行消化，400r/min，離心5min，加入培養(yǎng)基E重懸細(xì)胞，制成1×10⁶/ml單細(xì)胞懸液；

(3)將單細(xì)胞懸液接種至0.1％明膠預(yù)先包被的10ml細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)基E按照1：3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)；

步驟四：(一)組織工程表皮細(xì)胞的培養(yǎng)

1將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基E去除，加1mLDMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，離心5min，收集細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基E以1：3的比例進(jìn)行傳代，傳至已被Matrigel包被好的六孔板中；

2待間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)至六孔板的70％-80％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換培養(yǎng)基F，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天后，得到表皮細(xì)胞，加含0.5mMEDTA的DPBS進(jìn)行消化，400r/min，離心5min，加入培養(yǎng)基G重懸細(xì)胞，制成1×10⁶/ml單細(xì)胞懸液；

3將單細(xì)胞懸液接種至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合度達(dá)到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培養(yǎng)基G重懸細(xì)胞，制成1×10⁶/ml單細(xì)胞懸液，備用；

(二)組織工程成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

[1]同步驟四(一)中的1；

[2]待間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)至六孔板的70％-80％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換培養(yǎng)基H，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后，得到成纖維細(xì)胞，加含0.5mMEDTA的DPBS進(jìn)行消化，400r/min，離心5min，加入培養(yǎng)基I重懸細(xì)胞，制成5×10⁵/ml單細(xì)胞懸液；

[3]將單細(xì)胞懸液接種至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長(zhǎng)3天融合度達(dá)到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培養(yǎng)基I重懸細(xì)胞，制成5×10⁵單細(xì)胞懸液，備用；

(三)組織工程毛囊細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)

{1}同步驟四(一)中的1；

{2}待間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)至六孔板的70％-80％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換培養(yǎng)基J，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后，得到毛囊細(xì)胞，加含0.5mMEDTA的DPBS進(jìn)行消化，400r/min，離心5min，加入培養(yǎng)基K重懸細(xì)胞，制成5×10⁵/ml單細(xì)胞懸液；

{3}將單細(xì)胞懸液接種至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長(zhǎng)3天融合度達(dá)到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培養(yǎng)基K重懸細(xì)胞，制成5×10⁵單細(xì)胞懸液，備用；

步驟五：含有附屬器的組織工程雙層皮膚的構(gòu)建

I將羊膜打孔成與6板孔直徑相同的羊膜圓片；

II將成纖維細(xì)胞與毛囊細(xì)胞按0.9-1.1:1的比例混合，接種到羊膜基質(zhì)層，加入培養(yǎng)液I進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合度達(dá)到75-85％，在羊膜的上皮面接種表皮細(xì)胞，加入培養(yǎng)基G進(jìn)行培養(yǎng)；

III培養(yǎng)2天后表皮細(xì)胞緊貼于羊膜上皮面，將培養(yǎng)基G棄去，加入2mL培養(yǎng)液L繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液，培養(yǎng)2天，即得；

所述的DMEM/F12培養(yǎng)液體積比為9:1，并且以DMEM/F12體積比為9:1混合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制以下培養(yǎng)基，其中添加物濃度為終濃度：

培養(yǎng)基B：商用型REGM培養(yǎng)基與MEF培養(yǎng)基以1：1的體積比混合；

培養(yǎng)基D：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、L-谷酰胺2mmol/L、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子75ug/L、地塞米松10^-8mol/L；

培養(yǎng)基E：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、人表皮生長(zhǎng)因子20ng/mL、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子3ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2ng/mL、血小板衍生因子5ng/mL、胰島素樣生長(zhǎng)因子5ng/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β5ng/mL；

培養(yǎng)基F：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子20ug/L、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因-β45ug/L、血小板衍生因子-AB 8ug/L、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子15ug/L、白細(xì)胞介素-25ug/L、氫化可的松0.4ug/ml；

培養(yǎng)基G：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、氫化可的松0.5ng/mL、霍亂毒素1×10-10mol/L、胰島素0.05ng/mL、三碘甲狀腺原氨酸1×10-7mol/L、腺嘌呤1.8×10-4mol/L、青霉素100IU/mL、人表皮生長(zhǎng)因子15ng/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白10ug/mL、谷氨酸5ug/mL、ROCK抑制劑5μM、羧甲基殼聚糖0.1mg/mL；

培養(yǎng)基H：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ug/L、維生素C1mmol/L、非必需氨基酸0.02mmol/mL；

培養(yǎng)基I：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、胰島素5ng/mL、氫化可的松300ug/ml、腺嘌呤15ug/mL、維生素C120ug/mL、人表皮生長(zhǎng)因子5ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8ng/mL、BPE20ug/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白10ug/mL、羧甲基殼聚糖0.5mg/mL；

培養(yǎng)基J：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ug/mL、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ug/mL、wnt3a30-200ng/ml、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子12.5μg/ml、胰島素樣生長(zhǎng)因子50ng/ml、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子10ng/ml、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子20μg/L、神經(jīng)生長(zhǎng)因子15ng/ml、青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL、L-谷氨酰胺3mmol/L、胸腺素β40.015％；

培養(yǎng)基K：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、L-谷氨酰胺2.5mmol/L、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑1ng/mL、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ug/mL、胰島素3ng/ml；

培養(yǎng)基L：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml、胰島素0.05μmol/L、非必需氨基酸0.05mmol/mL、人表皮生長(zhǎng)因子10ng/mL、青霉素100IU/mL、牛垂體提取物20ug/mL、氯化鈣300μg/mL。