[發明專利]誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基和培養方法

有效

• 申請號: 201710393002.5
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107058214B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 車七石
• 申請（專利權）人: 廣州潤虹醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基和培養方法。本發明誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基包括DEME基礎培養基10?15g/L，甘露醇0.1?0.5mM，肝素鈉4?8U，L?谷氨酰胺1?1.5mM，丙酮酸鈉0.5?0.85mM，β?巰基乙醇0.15?0.2mM，粘連蛋白1?3mg/L，定向分化誘導因子27?39ng/mL和血清替代物。本發明誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基能有效促進誘導多能干細胞向腎臟細胞定向分化，且本發明培養基中無胎牛血清添加，避免了動物病原菌感染的風險。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基和培養方法。

背景技術

慢性腎臟疾病是臨床常見的多發病之一。據最新流行病學調查顯示，目前我國慢性腎臟疾病患者高達1.2億，患病率高達10.8％，且呈現逐年不斷增長的趨勢。腎臟移植術是臨床最有效的治療手段，但該技術存在供體短缺、同種異體排斥反應和終身服用免疫抑制劑等問題。因此，尋找到具有強大的再生能力且無排斥反應的種子細胞就成為了解決該問題的關鍵。目前用于再生醫學研究的細胞主要有成體干細胞和胚胎干細胞，但這兩種細胞均存在某些弊端，比如成體干細胞的數量和增殖能力有限；而胚胎干細胞的使用面臨道德倫理爭議問題。近年來，誘導性多能干細胞的出現為再生醫學的研究提供了比較理想的種子細胞。

IPS細胞是用反轉錄病毒將多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc轉染至體細胞，并使之重編程為能夠無限增殖與分化的一類細胞，它與胚胎干細胞類似，體內外均能無限增殖，可分化為人體內幾乎所有類型的細胞；同時，IPS具有取材簡便、無免疫排斥反應、無道德倫理爭議等優點，從而成為再生醫學治療研究中理想的種子細胞。但IPS細胞直接移植治療存在致癌風險，必須在體外將其誘導為相對成熟的腎臟細胞才能用于移植治療。

目前在再生研究領域中主要采用細胞因子進行定向誘導分化，研究發現生腎因子活化素A、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)、維甲酸(retinoic acid，RA)可以誘導鼠ES細胞向腎臟上皮細胞分化。利用Activin A、BMP4、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basicityfibroblast growth factor，b-FGF)等細胞因子誘導人ES細胞分化并得到一群早期的CD326^－CD56⁺細胞，而該群細胞可進一步分化為中胚層前體細胞。

黃佳卉等人在《體外誘導人iPS細胞向腎臟細胞定向分化的實驗研究》中將經Dispase消化后的iPS細胞采用機械切割法傳代，mTeSR培養液培養約3d至80％融合，進行實驗分組：對照組(正常mTeSR培養組)和誘導組(誘導培養液中含有以下因子：10ng/mL的生腎因子活化素A、BMP7、hVEGF和b-FGF，0.1mol/LRA，10μmol/L lithium)，隔日換液。誘導組培養21d后加入1/2體積的腎臟上皮細胞培養液繼續培養7d，同時觀察細胞形態變化(上海交通大學學報(醫學版)，2014，34(7):957-961.)。

目前，體外誘導人IPS細胞向腎臟細胞定向分化培養基，誘導率低，且培養基多含有胎牛血清，不能滿足研究生產的大量需要。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基。本發明定向分化培養基，能有效促進IPS細胞向腎臟細胞定向分化，本發明誘導多能干細胞定向分化腎臟細胞的培養基能有效促進誘導多能干細胞向腎臟細胞定向分化，用本發明制備的定向分化培養培養得到的腎臟細胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表達分別較未分化前的誘導多能干細胞均發生上調，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA可上調10、50、55和40倍，此外，本發明培養基中無胎牛血清添加，避免了動物病原菌感染的風險。