[發(fā)明專利]誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710393002.5
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107058214B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車七石
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州潤虹醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括DEME基礎(chǔ)培養(yǎng)基10-15g/L，甘露醇0.1-0.5mM，肝素鈉4-8U，L-谷氨酰胺1-1.5mM，丙酮酸鈉0.5-0.85mM，β-巰基乙醇0.15-0.2mM，粘連蛋白1-3mg/L，定向分化誘導(dǎo)因子27-39ng/mL和血清替代物；所述定向分化誘導(dǎo)因子由以下成分及濃度組成：活化素A11-12.5ng/mL，人血管內(nèi)皮生長因子7.5-9ng/mL，β-磷酸甘油3.5-7.5ng/mL及丹參酮ⅡA5-10ng/mL；

所述血清替代物由以下成分及其濃度組成：燕麥蛋白5-10g/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.3-0.5g/L，重組人表皮生長因子0.5-1.5ng/mL，成纖維細(xì)胞生長因子1-2ng/mL，血小板來源的生長因子0.75-2.5ng/mL，甘氨酸3.5-6.5g/L，脯氨酸0.1-0.3g/L，酪氨酸磷酸肽2-4g/L和維生素D0.3-1.2mg/L；

所述燕麥蛋白的提取方法為：稱取脫脂燕麥，按浸提料液質(zhì)量比1:9的比例加入pH值為10.2的氫氧化鈉溶液進(jìn)行浸提：浸提溫度為46℃，浸提時(shí)間為3h，10000r/min離心20min，取上清液并用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，10000r/min離心20min，將沉淀物水洗兩次后噴霧干燥即得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1收集活化后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，4℃，200g/min離心3-5min后棄上清后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液1-3mL懸浮細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液到15mL離心管中，200g/min離心3-5min，棄上清加入2mL胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)；

S2吸取S1中培養(yǎng)2小時(shí)后的細(xì)胞懸液，按體積比1:20-1:25接種量接種于含成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3-4天后，更換所述定向分化培養(yǎng)基，并定期觀察，即得。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1中細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉和7.5mg/L甘氨酰丙氨酸。