[發明專利]細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白、其可溶性表達方法及其純化方法和應用

在審

• 申請號: 201710391543.4
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107099519A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 景濤;辛奇;宋曉霞;袁苗苗;李煥平;高海軍;孫旭東;魯俊;那斌;呂薇
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;G01N33/573
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 呂玉博

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白、其可溶性表達方法及其純化方法和應用。

背景技術

轉二羥基丙酮激酶是磷酸戊糖途徑非氧化階段的關鍵酶，其主要作用在于調控磷酸戊糖途徑產生5-磷酸核糖和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，前者是細胞增殖過程中合成核苷酸不可缺少的原料，參與核苷酸、輔酶A和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸等分子的合成代謝；后者是生物體內重要的還原當量，不僅維持谷胱甘肽于還原狀態，而且作為供氫體直接參與多種代謝反應，廣泛參與胞內信號轉導、抗氧應激等。基于以上研究背景，本發明構建了編碼細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶基因的原核表達質粒，轉化入大腸桿菌表達系統，誘導其表達，并進行蛋白純化，得到了該蛋白，為其免疫原性、組織定位以及酶學特性等功能研究奠定了基礎，為包蟲病治療藥物的研究提供了有效的藥物靶點，并有望用于囊型包蟲病患者的免疫診斷。

發明內容

本發明通過基因工程技術，提供了一種細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶的原核表達載體pET30a-轉二羥基丙酮激酶，利用該載體轉化大腸桿菌（BL21-DE3）實現了轉二羥基丙酮激酶的高水平可溶性表達。并提供了一種親和層析純化方法，純化出了大量的高純度的重組轉二羥基丙酮激酶，用于轉二羥基丙酮激酶生化特性分析、功能的研究及囊型包蟲病患者的免疫診斷。

本發明提供細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白，所述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

作為優選，所述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白編碼的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1中第42-1022位堿基。

本發明還提供上述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的可溶性表達，步驟如下：

（1）目的基因轉二羥基丙酮激酶的擴增；

（2）構建轉二羥基丙酮激酶表達質粒：將步驟（1）制備的目的基因轉二羥基丙酮激酶酶切并純化后，構建入pET-30a相應的多克隆酶切位點，構建質粒pET30a-轉二羥基丙酮激酶；

（3）將步驟（2）制備的質粒pET30a-轉二羥基丙酮激酶轉化入E.Coli BL21(DE3)感受態細胞中，活化表達轉二羥基丙酮激酶的E．coli BL21(DE3)菌體，將活化表達的菌液加入LB液體培養基中，振蕩培養2-3小時，至A₆₀₀達到0.5；加入0.4mmol/L 的IPTG在18℃， 150 r/min誘導振蕩培養7h，離心收集細菌，超聲，收集上清液。

本發明還提供上述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的純化方法，是使用Ni-NTA His-Bind（Novagen）預裝柱純化細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白，然后使用6號洗脫液進行洗脫；所述6號洗脫液的配方為：500mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0。

作為優選，步驟如下：

（1）加入超純水于Ni-NTA預裝柱中，使其緩慢的流過柱內填充的介質；

（2）加入結合緩沖液；所述結合緩沖液的配方為：50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（3）上樣，加入通過超聲破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-轉二羥基丙酮激酶提取的上清液，使其緩慢流過柱內介質；

（3）用漂洗緩沖液沖洗預裝柱；所述漂洗緩沖液的配方為：50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl ，20mM/L咪唑，pH8.0；

（4）加入1號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述1號洗脫液的配方為：50mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（5）加入2號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述2號洗脫液的配方為：100mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（6）加入3號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述3號洗脫液的配方為：200mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；