[發明專利]細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白、其可溶性表達方法及其純化方法和應用

在審

• 申請號: 201710391543.4
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107099519A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 景濤;辛奇;宋曉霞;袁苗苗;李煥平;高海軍;孫旭東;魯俊;那斌;呂薇
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;G01N33/573
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 呂玉博

1.細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白，其特征在于：所述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。

2.根據權利要求1所述的細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白，其特征在于：所述細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白編碼的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1中 42-1022位堿基。

3.權利要求1或2所述的細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的可溶性表達，其特征在于：步驟如下：

（1）目的基因轉二羥基丙酮激酶的擴增；

（2）構建轉二羥基丙酮激酶表達質粒：將步驟（1）制備的目的基因轉二羥基丙酮激酶酶切并純化后，構建入pET-30a相應的多克隆酶切位點，構建質粒pET30a-轉二羥基丙酮激酶；

（3）將步驟（2）制備的質粒pET30a-轉二羥基丙酮激酶轉化入E.Coli BL21(DE3)感受態細胞中，活化表達轉二羥基丙酮激酶的E．coli BL21(DE3)菌體，將活化表達的菌液加入LB液體培養基中，振蕩培養2-3小時，至A₆₀₀達到0.5；加入0.4mmol/L 的IPTG在18℃，誘導振蕩培養7h，離心收集細菌，超聲，收集上清液。

4.權利要求1或2所述的細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白的純化方法，其特征在于：是使用Ni-NTA His-Bind（Novagen）預裝柱純化細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白，然后使用6號洗脫液進行洗脫；所述6號洗脫液的配方為：500mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0。

5.根據權利要求4所述的純化方法，其特征在于：步驟如下：

（1）加入超純水于Ni-NTA預裝柱中，使其緩慢的流過柱內填充的介質；

（2）加入結合緩沖液；所述結合緩沖液的配方為：50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（3）上樣，加入通過超聲破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-轉二羥基丙酮激酶提取的上清液，使其緩慢流過柱內介質；

（3）用漂洗緩沖液沖洗預裝柱；所述漂洗緩沖液的配方為：50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl ，20mM/L咪唑，pH8.0；

（4）加入1號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述1號洗脫液的配方為：50mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（5）加入2號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述2號洗脫液的配方為：100mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（6）加入3號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述3號洗脫液的配方為：200mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（7）加入4號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述4號洗脫液的配方為：300mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（8）加入5號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質；所述5號洗脫液的配方為：400mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0；

（9）加入6號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質，收集洗脫液；所述6號洗脫液的配方為：500mM /L咪唑，50mM/L NaH₂PO₄，300mM/L NaCl，pH8.0。

6.權利要求1或2所述的細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白在制備檢測細粒棘球蚴病的ELISA試劑盒中的應用。

7.一種檢測細粒棘球蚴病的ELISA試劑盒，其特征在于：所述ELISA試劑盒中包被抗原為權利要求1或2所述的細粒棘球絳蟲轉二羥基丙酮激酶重組蛋白。