[發明專利]固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法

有效

• 申請號: 201710387577.6
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107860827B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 王旭;邢燕;陳毓;吳淑春;趙小菁;徐敬敬
• 申請（專利權）人: 杭州醫學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74
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固相萃取?高效液相色譜?熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法，包括如下步驟，S1、樣品的預處理；S2、樣品的制備，采用自制固相萃取柱進行固相萃取；S3、標準溶液的配制；S4、標準曲線的繪制：S5、測定：取用S2獲得的樣品上樣，進行HPLC分析，保留時間定性，峰面積定量，醋酸纖維為載體，柚子皮瓤粉作為吸附劑，柚子皮瓤粉均勻分布在醋酸纖維的間隙內，柚子皮瓤粉對尿液中的單胺類神經遞質及其代謝物具有優異的靈敏度和選擇性，使得人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物富集在柚子皮瓤粉上，大大提高了樣品的純凈度和靈敏度，降低了檢出限，提高了回收率，提高了檢測的效率；成本低廉，可以降低檢測成本。

技術領域

本發明涉及人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物測定方法技術領域，特別是涉及固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法。

背景技術

神經遞質是神經末梢分泌的化學物質，在化學突觸傳遞中擔當信使的作用。單胺類神經遞質(MNTs)是最早發現的一類，包括多巴胺(DA)、腎上腺素(EP)、去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)及其代謝產物香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)。MNTs在中樞神經系統、外周植物神經系統和激素介導的內分泌及外分泌活動中起著極其重要的作用。固相萃取(Solid-Phase Extraction，簡稱SPE)是近年發展起來一種樣品預處理技術，由液固萃取和柱液相色譜技術相結合發展而來，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，正成為復雜樣品的凈化、富集的有效手段。

人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物含量的準確檢測，對嗜鉻細胞瘤等相關疾病診斷、新藥研制開發、評價藥物療效等方面有重要意義。由于人體尿液基質非常復雜，且單胺類神經遞質在尿液中的含量較低，因此對檢測方法的靈敏度和選擇性都提出較高的要求。MNTs的檢測方法主要有電化學分析法、熒光法、高效液相色譜-熒光檢測法、高效液相色譜-電化學檢測法、毛細管電泳法、色譜-質譜聯用法。電化學分析法測定生物樣品的穩定性較差，且修飾電極的使用壽命有限，靈敏度不高。毛細管電泳法的重現性較差。MNTs本身質譜響應信號不強，準確測定存在困難，且色譜-質譜昂貴。

為此，申請人發表了一篇名為“固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質”的文獻，通過優化前處理條件和色譜分析條件，采用了Waters Oasis WCX固相萃取柱富集、凈化，高效液相色譜熒光(HPLC-FLD)檢測法測定了人體尿液中4種單胺類神經遞質的含量，在該優化的實驗條件下，4種單胺類神經遞質的回收率為92.2％～104.8％，相對偏差為1.6％～3.1％，檢出限為0.002～0.05μg/ml，建立的高效液相色譜熒光檢測法快速、簡便，能滿足人體尿液中多種單胺類神經遞質的含量測定。

然而，Waters Oasis WCX固相萃取柱對其代謝產物香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的選擇性、靈敏性以及重現性效果不夠理想，因此，還難以同時對單胺類神經遞質及其代謝產物進行快速有效的檢測，且Waters Oasis WCX固相萃取柱是消耗品，用量大，如果在醫院大規模推廣應用，勢必需要考慮成本因素，而且，如何進一減少尿液中的干擾組分，研發出新的固相萃取柱對尿液中單胺類神經遞質及其代謝產物具有更優異的選擇性，提高分析物的純凈度，降低檢出限，提高靈敏度，減少檢測次數，提高檢測結果的準確性，加快檢測速度，降低檢測成本，是目前亟需解決的問題。

發明內容

為了克服上述缺點和不足，本發明的目的在于提供固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法，包括以下步驟：