[發明專利]固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法

有效

• 申請號: 201710387577.6
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107860827B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 王旭;邢燕;陳毓;吳淑春;趙小菁;徐敬敬
• 申請（專利權）人: 杭州醫學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、樣品的預處理：取新鮮人體尿液2ml，加200μl 1mol/L的鹽酸溶液將尿液進行酸化處理，隨后加入2.0ml 0.5mol/L的乙酸銨，混勻，超聲5min后，以5000r/min離心10min，取上清液，經0.45μm濾膜過濾，濾液于4℃冰箱保存待用；

S2、樣品的制備：將柚子皮瓤烘干粉碎過300～500目篩，得到柚子皮瓤粉，然后柚子皮瓤粉在真空條件下焙燒0.6-1h，焙燒的溫度為300-550℃，獲得柚子皮瓤吸附劑，把香煙過濾嘴內的醋酸纖維填充在SPE玻璃管內，然后再添加柚子皮瓤吸附劑，加上墊片，獲得自制固相萃取柱；依次用5ml甲醇、5ml水活化自制固相萃取柱，取上述處理過的尿樣4ml上樣，流速為1ml/min，依次用2ml 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液、2ml甲醇淋洗雜質，最后用5ml含2％甲酸的體積比為85∶15的乙腈水溶液洗脫被分析物，流速為1ml/min，所得洗脫液氮吹至近干，用初始流動相復溶至1.0ml，超聲2min后，經0.22μm濾膜過濾后，供HPLC分析；所述SPE玻璃管的體積為5ml，所述SPE玻璃管內設有第一過濾擋片和第二過濾擋片，所述第一過濾擋片和所述第二過濾擋片將所述SPE玻璃管分成第一吸附段、第二吸附段和第三吸附段，所述第一吸附段、所述第二吸附段和所述第三吸附段體積相等；所述第一吸附段和所述第三吸附段內填充有85-100mg的醋酸纖維，然后添加有120-150mg所述柚子皮瓤吸附劑；所述第二吸附段內填充有150-200mg的醋酸纖維，然后添加有250-300mg所述柚子皮瓤吸附劑；

S3、標準溶液的配制：準確稱取腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、香草扁桃酸、高香草酸和5-羥吲哚乙酸標準品各20mg，分別置于10ml容量瓶中，0.01mol/L的鹽酸溶液定容，充分震蕩使其溶解，得濃度均為2000μg/ml的標準儲備液，保存于4℃冰箱中；

S4、標準曲線的繪制：準確吸取腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、香草扁桃酸、高香草酸和5-羥吲哚乙酸7種標準儲備液用0.01mol/L的鹽酸溶液稀釋為腎上腺素30.0μg/ml、去甲腎上腺素50.0μg/ml、多巴胺50.0μg/ml、5-羥色胺20.0μg/ml、香草扁桃酸60.0μg/ml、高香草酸65.0μg/ml和5-羥吲哚乙酸70.0μg/ml的標準應用液，分別準確吸取標準應用液0.01、0.05、0.30、1.00、2.00ml、2.50ml和2.50ml于10ml容量瓶中，初始流動相定容，用HPLC分析，繪制標準曲線；

S5、測定：取用S2獲得的樣品上樣，進行HPLC分析，保留時間定性，峰面積定量，其中，HPLC的色譜條件如下，采用反相液相色譜柱Agilent C18色譜柱，型號為250mm×4.6mm，5μm；進樣量為10μl；熒光檢測激發波長280nm，發射波長340nm；柱溫為30℃；流動相為甲醇與緩沖液的混合溶液；所述緩沖液為含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉的0.04mol/L乙酸鈉溶液，pH＝4；甲醇與所述緩沖液的流量為1.0mL/min；流動相的具體的梯度為，在0-6min時，甲醇與所述緩沖液的體積比為10∶90；在6-18min時，甲醇與所述緩沖液的體積比為2∶98，在18-19min時，甲醇與所述緩沖液的體積比為20∶80，在19-30min時，甲醇與所述緩沖液的體積比為2∶98，在30-40min時，甲醇與所述緩沖液的體積比為1∶98。

2.根據權利要求1所述的固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法，其特征在于，所述第二吸附段內還添加有60-80g多孔醋酸纖維素微球。

3.根據權利要求2所述的固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質及其代謝物的方法，其特征在于，所述醋酸多孔醋酸纖維素微球的比表面積22m²/g，粒徑為1～10微米，平均粒徑6微米，平均孔徑1.2微米。