[發明專利]一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法

在審

• 申請號: 201710387339.5
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107041363A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 王惠娥;焦海紅;汪瀾;張強;支松;賈珊珊;芮雪
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法技術領域，具體為一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法。

背景技術

綿羊精液保存技術自發明以來，成為提高優良種畜利用率、加速品種改良最有效之一，而且能降低繁殖成本，對人工授精技術的推廣應用，對養羊業的發展都產生了巨大的推動作用。精液的保存方法分為冷凍保存、低溫保存和常溫保存。

冷凍保存是為了品種資源的保存和地域間種質交流，可長期保持；低溫保存(0～5℃)和常溫保存(15～25℃)可以擴大精液量，提高種畜利用率，方法簡單，但保存時間短。

目前，綿羊人工授精所用精液仍多為鮮精，其原因是綿羊的精液冷凍保存效果不盡理想，尚難在生產上推廣的現狀下，液態保存精液有很大的應用前景。

現有的綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法中，稀釋液成分大多比較復雜、繁多，保存效果也并不十分理想，保存時間一般在5～72小時，降低了優良種公羊利用率，增加養羊成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法，以解決上述背景技術中提出的稀釋液成分大多比較復雜、繁多，保存效果也并不十分理想，保存時間一般在5～72小時，降低了優良種公羊利用率，增加養羊成本的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實驗方法，包括以下步驟：

1)、提取綿羊的新鮮精液，并將提取的新鮮精液放進集精杯中；

2)、將步驟1)中盛有精液的集精杯放在保溫桶水浴，并將提取的精液運回至實驗室，運輸過程中防止保溫桶劇烈震蕩；

3)、準備制作稀釋液的原材料，Tris、檸檬酸、乳糖、花青素、VC、青霉素和鏈霉素；

4)、采用步驟1)中的原材料分別配制以下四種稀釋液，其中稀釋液I的配方為 Tris1.92g，檸檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液II的配方為Tris2.64g，檸檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液III的配方為 Tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液III的配方為Tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g，稀釋液IV的配方為 Tris3.53g，檸檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；

5)、將步驟4)制作的稀釋液放在37℃水浴鍋中，使稀釋液的溫度升溫到37℃，并使鮮精溫度和稀釋液溫度一致，達到溫度的平衡；

6)、對步驟2)中的鮮精進行稀釋，取0.4mL鮮精加入到塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6mL等溫的稀釋液I，得到稀釋精液I，之后再取0.4mL鮮精加入到另一只新的塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6mL等溫的稀釋液II，得到稀釋精液II，依次制作稀釋精液III與稀釋精液IV；

7)、對步驟6)中稀釋精液I、II、III、IV進行保存，將離心管蓋蓋緊后放在泡沫的離心管架，室溫放置保存；

8)、對步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子活率進行測定，先將分層的精液用移液槍輕輕吹打混勻，靜止5min后，吸取10μL稀釋精液I滴在37℃的載玻片上，蓋上蓋玻片，置400×光學顯微鏡下進行觀察確定，至少觀察5個不同視野，每個視野觀察20個精子，記錄存活精子數，算出精子活率，運動的精子占精子總數的比例即為精子活力，精子中呈直線運動的精子數占精子總數的百分比即為精子活率，然后依次對稀釋精液II、III、IV的精子活率進行測定；

9)、對步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子頂體完整率進行檢查，取5μL 稀釋精液I滴在37℃的載玻片然后加入5μL PBS液稀釋，將精子密度調整為每毫升1×10⁶個，在載玻片上涂片，采用烘片機烘干，然后滴加6.8％重鉻酸鉀固定30min，用自來水流水沖洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆薩染色混合液染色1.5h，再次用自來水流水沖洗染液，自然晾干，放在400×顯微鏡下觀察200個精子，計數頂體完整的精子數量，計算出頂體完整率，然后依次計算出稀釋精液II、III、IV中的精子頂體完整率；