[發(fā)明專利]一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法

在審

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• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN107041363A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王惠娥;焦海紅;汪瀾;張強(qiáng);支松;賈珊珊;芮雪
• 申請（專利權(quán)）人: 塔里木大學(xué)
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

1.一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)、提取綿羊的新鮮精液，并將提取的新鮮精液放進(jìn)集精杯中；

2)、將步驟1)中盛有精液的集精杯放在保溫桶水浴，并將提取的精液運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程中防止保溫桶劇烈震蕩；

3)、準(zhǔn)備制作稀釋液的原材料，Tris、檸檬酸、乳糖、花青素、VC、青霉素和鏈霉素；

4)、采用步驟1)中的原材料分別配制以下四種稀釋液，其中稀釋液I的配方為Tris1.92g，檸檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液II的配方為Tris2.64g，檸檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液III的配方為Tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液III的配方為Tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g，稀釋液IV的配方為Tris3.53g，檸檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，VC0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；

5)、將步驟4)制作的稀釋液放在37℃水浴鍋中，使稀釋液的溫度升溫到37℃，并使鮮精溫度和稀釋液溫度一致，達(dá)到溫度的平衡；

6)、對步驟2)中的鮮精進(jìn)行稀釋，取0.4mL鮮精加入到塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6mL等溫的稀釋液I，得到稀釋精液I，之后再取0.4mL鮮精加入到另一只新的塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6mL等溫的稀釋液II，得到稀釋精液II，依次制作稀釋精液III與稀釋精液IV；

7)、對步驟6)中稀釋精液I、II、III、IV進(jìn)行保存，將離心管蓋蓋緊后放在泡沫的離心管架，室溫放置保存；

8)、對步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子活率進(jìn)行測定，先將分層的精液用移液槍輕輕吹打混勻，靜止5min后，吸取10μL稀釋精液I滴在37℃的載玻片上，蓋上蓋玻片，置400×光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察確定，至少觀察5個(gè)不同視野，每個(gè)視野觀察20個(gè)精子，記錄存活精子數(shù)，算出精子活率，運(yùn)動(dòng)的精子占精子總數(shù)的比例即為精子活力，精子中呈直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占精子總數(shù)的百分比即為精子活率，然后依次對稀釋精液II、III、IV的精子活率進(jìn)行測定；

9)、對步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子頂體完整率進(jìn)行檢查，取5μL稀釋精液I滴在37℃的載玻片然后加入5μL PBS液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，在載玻片上涂片，采用烘片機(jī)烘干，然后滴加6.8％重鉻酸鉀固定30min，用自來水流水沖洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆薩染色混合液染色1.5h，再次用自來水流水沖洗染液，自然晾干，放在400×顯微鏡下觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)頂體完整的精子數(shù)量，計(jì)算出頂體完整率，然后依次計(jì)算出稀釋精液II、III、IV中的精子頂體完整率；

10)、對步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測，取10μL稀釋精液I用PBS液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，孵育后取10μL調(diào)整后的懸液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在400×光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算彎尾占總精子數(shù)的百分率，其中精子尾部彎尾就是精子質(zhì)膜完整率，然后依次對稀釋精液II、III、IV中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行計(jì)算。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟1)中提取精液的對象為多浪羊和策勒黑羊公羊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2)中保溫桶水浴的溫度為37℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2)中運(yùn)輸時(shí)間不能超過半小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟6)中加稀釋液時(shí)沿著離心管的管壁將稀釋液加入精液，邊加邊混勻。