[發明專利]一種水稻懸浮細胞系快速培養的方法

有效

• 申請號: 201710387169.0
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107006374B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 陳越;程在全;付堅;王波;鐘巧芳;肖素勤;陳玲;柯學;張敦宇;殷富有;王玲仙;余騰瓊;蔣聰;李娥賢;黃興奇
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

本發明涉及一種水稻懸浮細胞系快速培養的方法，屬生物技術領域。該水稻懸浮細胞系快速培養的方法包括：外植體的選擇、外植體的滅菌、愈傷組織的誘導、愈傷組織的繼代、懸浮細胞的培養步驟。本發明對培養懸浮細胞培養基和繼代時處理懸浮細胞的方法進行了改進。即繼代時處理懸浮細胞時，在繼代第3次液體培養基后用孔徑大小依次約為10目，20目，40目已滅菌的篩網對懸浮培養的細胞進行篩選，濾去大顆粒細胞團，只留下大小均一的細胞團，用此法1.5?2個月就能夠建立起良好的胚性懸浮細胞系。該方法成本低、操作簡單、縮短試驗周期，降低了懸浮細胞系污染的風險，是一種高效、快速的新方法，也為利用水稻懸浮細胞系作為實驗材料的相關研究提供了一個平臺。

技術領域

本發明涉及一種水稻懸浮細胞系快速培養的方法，屬生物技術領域。

背景技術

水稻是世界上重要的糧食作物之一，是世界上50％以上人口的主食同時也是遺傳學和基因組研究的模式植物之一。疣粒野生稻主要分布于在我國的云南省及海南省。野生稻由于長期處于野生狀態，經受了各種災害和不良環境的自然選擇，抗逆性較強，是天然的基因庫，保持有栽培稻不具有或已經消失了的有利基因。

懸浮細胞系具有來源統一，遺傳背景一致，不存在植株研究中個體差異的影響；生長條件容易控制，生理狀態基本相同，避免了環境的干擾；發生各種反應更為迅速一致；具有較好的細胞全能性。水稻細胞懸浮系不僅可以直接應用于原生質體分離、培養與雜交、基因轉移和生產次生代謝物等，還可以在細胞水平上短期內篩選出預期突變體，培育水稻新品種等，利用懸浮細胞也可以保護和繁育瀕危野生稻品種。因此，懸浮細胞培養已成為植物生物技術中最有效的手段之一。

水稻的幼胚和成熟胚誘導出胚性愈傷組織可以保持胚性，能夠分化出完整的再生植株，但是其顆粒堅硬，分散困難，需要長時間的生長過程，才能培養出繁殖較快的細胞系，目前文獻報道的建立水稻懸浮系的時間多為3-4個月，因水稻懸浮細胞的培養操作是在超凈臺的無菌操作，且每5-7天需要補充新鮮液體培養基進行繼代，繁瑣的實驗環節、過長的實驗周期不僅增加了材料污染的風險而且也嚴重阻礙著水稻懸浮培養在實踐中的應用。因此，尋找一種既能縮短水稻懸浮細胞系建立的周期，又易于操作的方法是本領域科技人員長期想探索的技術問題。

迄今為止，未見在較短的時間(1.5-2個月)內建立起水稻懸浮細胞系的公開報道。

發明內容

本發明目的在于解決現有技術中獲得水稻懸浮細胞系周期過長的問題，提供一種快速建立水稻懸浮細胞系的方法。

本發明的快速建立水稻懸浮細胞系的方法，其具體步驟如下：

a.外植體的選擇：選擇成熟胚或幼胚，裝于透氣網袋中，置于4℃冰箱中保存備用；

b.外植體滅菌：取出保存于4℃冰箱中的成熟胚或幼胚，剝去其穎殼，放入已滅菌的100mL三角瓶中用體積百分比為75％的酒精浸泡1分鐘進行表面消毒，搖動三角瓶，無菌蒸餾水沖洗5-6次，再用體積百分比為15％的次氯酸鈉溶液消毒，每50mL次氯酸鈉溶液加1滴Tween20，在搖床中室溫110r/min黑暗下振蕩15分鐘或18分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗10次或12次，最后用不添加Tween20的體積百分比為15％的次氯酸鈉溶液在搖床中室溫110r/min黑暗下振蕩15分鐘消毒，消毒后用無菌蒸餾水沖洗10次或12次，直到清洗后的水中沒有次氯酸鈉溶液殘留；

c.愈傷組織的誘導：消毒后將胚放在無菌濾紙上于超凈臺上風干表面多余的水分，用滅菌的鑷子將胚接種于N6誘導培養基中，每皿8顆或12顆種子，置于培養箱中28℃、2000Lux光照培養，光照時間為每天6:00-22:00時，經10天或25天長出愈傷組織，N6誘導培養基配方為：N6+2.8mg/L 2,4-D+300mg/L水解絡蛋白+1.0g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+3.0g/L植物凝膠，pH5.6-5.8；