[發明專利]一種水稻懸浮細胞系快速培養的方法

有效

• 申請號: 201710387169.0
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107006374B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 陳越;程在全;付堅;王波;鐘巧芳;肖素勤;陳玲;柯學;張敦宇;殷富有;王玲仙;余騰瓊;蔣聰;李娥賢;黃興奇
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

1.一種水稻懸浮細胞系快速培養的方法，其特征在于水稻為栽培稻02428或疣粒野生稻的培養方法的具體步驟如下：

a.外植體的選擇：選擇成熟胚或幼胚，裝于透氣網袋中，置于4℃冰箱中保存備用；

b.外植體滅菌：取出保存于4℃冰箱中的成熟胚或幼胚，剝去其穎殼，放入已滅菌的100mL三角瓶中用體積百分比為75％的酒精浸泡1分鐘進行表面消毒，搖動三角瓶，無菌蒸餾水沖洗5-6次，再用體積百分比為15％的次氯酸鈉溶液消毒，每50mL次氯酸鈉溶液加1滴Tween20，在搖床中室溫110r/min黑暗下振蕩15分鐘或18分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗10次或12次，最后用不添加Tween20的體積百分比為15％的次氯酸鈉溶液在搖床中室溫110r/min黑暗下振蕩15分鐘消毒，消毒后用無菌蒸餾水沖洗10次或12次，直到清洗后的水中沒有次氯酸鈉溶液殘留；

c.愈傷組織的誘導：消毒后將胚放在無菌濾紙上于超凈臺上風干表面多余的水分，用滅菌的鑷子將胚接種于N6誘導培養基中，每皿8顆或12顆種子，置于培養箱中28℃、2000Lux光照培養，光照時間為每天6:00-22:00時，經10天或25天長出愈傷組織，N6誘導培養基配方為：N6+2.8mg/L 2,4-D+300mg/L水解絡蛋白+1.0g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+3.0g/L植物凝膠，pH5.6-5.8；

d.愈傷組織繼代：將誘導出的愈傷組織用滅菌的手術刀切割成3mm或4mm后接種于N6繼代培養基，每皿12枚愈傷塊；將接種愈傷的培養皿放到培養箱中在28℃、空氣相對濕度60％、以2000Lux光照培養，光照時間為每天6:00-22:00時，每12天繼代一次，N6繼代培養基配方為：N6+2.5mg/L 2,4-D+300mg/L水解絡蛋白+1.0g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+0.5g/LMES+3.0g/L植物凝膠，pH5.6-5.8；

e.懸浮細胞的培養：選取組培常規方法繼代2次以上的0.48g或0.52g質地堅硬、結構致密、顆粒松散、顏色鮮黃的愈傷加入到含有30mL N6液體培養基的100mL三角瓶中，置于往復式搖床上28℃、110r/min黑暗條件培養，每5天繼代1次，每次繼續代時傾去占總體積2/3的上清液，補充新鮮的N6液體培養基至30mL繼續培養，上述條件繼代2次，從繼代第3次開始，每次繼代傾去占總體積2/3的上清液并補充新鮮的N6液體培養基至30mL后用10目已滅菌的篩網過濾懸浮細胞，只保留能通過10目篩網的懸浮細胞繼續培養；從繼代第6次或第7次開始，每次繼代傾去占總體積2/3的上清液并補充新鮮的N6液體培養基至30mL后用已滅菌的20目不銹鋼篩網過濾懸浮細胞，只保留能通過20目篩網的懸浮細胞繼續培養；從繼代第8次或第9次開始，每次繼代時傾去占總體積2/3的上清液并補充新鮮的N6液體培養基至30mL后用40目已滅菌的篩網過濾懸浮細胞，只保留能通過40目篩網的懸浮細胞繼續培養；到繼代第10次或第11次即第50天或55天時，傾去占總體積2/3的上清液并補充新鮮的N6液體培養基至30mL后用40目已滅菌的篩網過濾懸浮細胞，只保留能通過40目篩網的懸浮細胞即獲得生長狀態均一，分散性好，如沙塵狀的細胞團即懸浮細胞系。