[發(fā)明專利]一種載GPP?siRNA牙科種植體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710386373.0
• 申請(qǐng)日: 2017-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN107296984A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張力;周青;宋文;張玉梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/54
• 分類號(hào): A61L27/54;A61L27/06;A61L27/08;A61L27/02;C25D11/26;C25D9/08;C25D7/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司61200
• 代理人: 徐文權(quán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于牙科種植體材料領(lǐng)域，特別涉及一種載GPP-siRNA牙科種植體的制備方法。

背景技術(shù)

鈦種植體在牙科使用廣泛，成功率高。但是，系統(tǒng)性骨疾病(如骨質(zhì)疏松)患者仍存在骨形成能力弱、骨結(jié)合不良等現(xiàn)象，增加了種植失敗的風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)斐煞N植體脫落導(dǎo)致種植的失敗，限制了其應(yīng)用。

表面處理是提高種植體骨結(jié)合的有效途徑。針對(duì)種植體表面處理的研究主要包括兩個(gè)方面：一方面，表面形貌修飾如表面形貌納米化等能夠影響骨形成。另一方面，表面生物修飾如加載生物因子實(shí)現(xiàn)表面功能化。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、siRNA、miRNA等都可作為生物因子加載于種植體表面，對(duì)體內(nèi)外骨結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)作用。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)能夠特異性的調(diào)控目標(biāo)基因，具有靶向、特異及高效性。siRNA與miRNA因其本身有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，可以作用于全身多個(gè)組織器官，同時(shí)具有高度特異性、固有生物學(xué)效應(yīng)和良好的基因沉默效率，在疾病治療過程中，針對(duì)相應(yīng)的疾病，引入外源性的特定siRNA/miRNA，使其轉(zhuǎn)染進(jìn)入特定組織器官，到達(dá)細(xì)胞指定部位發(fā)揮作用，結(jié)合并降解相應(yīng)mRNA，使疾病相關(guān)基因沉默，從而達(dá)到治療疾病的效果。RNAi可應(yīng)用于多種骨組織類型的治療，主要是骨和軟骨。以往研究中，已發(fā)現(xiàn)多種可以促進(jìn)成骨的siRNA與miRNA，如miR-29a、miR-31、siRANCL、siCki-1等應(yīng)用于種植體表面修飾促進(jìn)骨形成。

siRNA/miRNA能否發(fā)揮作用，很大程度上依賴于能夠有效地將其傳遞至目標(biāo)細(xì)胞和目標(biāo)部位的基因傳遞系統(tǒng)，即安全有效的基因載體。基因載體主要包括病毒基因載體和非病毒基因載體。非病毒性基因載體有著低成本、低免疫原性、非傳染性、良好的依從性和臨床重復(fù)應(yīng)用等一系列潛在的優(yōu)勢(shì)，使基因載體的良好選擇。非病毒載體主要有脂質(zhì)體、殼聚糖、聚乙烯亞胺等。這些非病毒載體應(yīng)用廣泛，但在應(yīng)用于種植體表面基因加載則有各自的缺陷。脂質(zhì)體加載不易，殼聚糖轉(zhuǎn)染效率有限，聚乙烯亞胺細(xì)胞毒性較高。因此，選擇一種容易加載，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小的基因載體十分重要。

近年來、石墨烯及其衍生物在生物傳感器、抗菌、藥物輸送、基因轉(zhuǎn)染及光熱治療等方面取得了突破性進(jìn)展。在骨形成方面，氧化石墨烯及其衍生物加載于材料表面能夠改變材料表面理化性質(zhì)，在成骨誘導(dǎo)液環(huán)境中，表現(xiàn)出一定的對(duì)骨形成的促進(jìn)作用。應(yīng)用于基因載體時(shí)，氧化石墨烯GO表面雙功能化的修飾上兩個(gè)不同類型的聚合物---PEI(聚乙烯亞胺)和PEG(聚乙二醇)，PEI用于結(jié)合核酸分子而PEG用于增強(qiáng)生理環(huán)境中的穩(wěn)定性。該雙聚合物功能化的氧化石墨烯即GPP(nGO-PEG-PEI)在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，展現(xiàn)出免于血清干擾，轉(zhuǎn)染效率提高的良好特性，是良好的基因載體的選擇。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中siRNA和載體形成復(fù)合物后在種植體表面siRNA加載量較少、加載量可控性低、載體轉(zhuǎn)染效率不高等缺陷，其目的在于提供一種載GPP-siRNA牙科種植體的制備方法，能夠在保證納米管形貌不受影響的情況下，高效的加載siRNA，使其在種植體表面發(fā)揮高效的RNA干擾作用促進(jìn)種植體骨結(jié)合。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種載GPP-siRNA牙科種植體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，選用純鈦或者鈦合金加工成種植體基體，再將種植體基體表面拋光后，超聲清洗后吹干，得到純鈦或者鈦合金牙科種植體；

步驟2，采用HF溶液陽極氧化的方法在步驟1得到的種植體表面制備二氧化鈦納米管陣列，超聲清洗后干燥，得到二氧化鈦納米管種植體；

步驟3，將GPP溶液與siRNA按合適比例混合形成GPP-siRNA混合物溶液；

步驟4，采用陰極電沉積工藝制備載GPP-siRNA的二氧化鈦納米管種植體：陰極為步驟2中制備的二氧化鈦納米管種植體，陽極為鉑片，電解液為步驟3中得到的GPP-siRNA混合物溶液，用直流電源通電，可將GPP-siRNA混合物沉積到二氧化鈦納米管種植體表面，獲得二氧化鈦納米管載GPP-siRNA的牙科種植體。

步驟1所述鈦合金為Ti-Zr-Sn-Mo-Nb合金，其中Ti、Zr、Sn、Mo和Nb的原子摩爾比為72:5:3:5:15。

步驟1中的超聲清洗依次用丙酮、無水乙醇和去離子水進(jìn)行，每次清洗15分鐘。