[發(fā)明專利]一種利用ISSR反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710385912.9
• 申請(qǐng)日: 2017-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN107164476B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧丙越;馬孟莉;雷恩;王田濤;孟衡玲;袁盛勇;劉艷紅;蘇一蘭;李春燕;張薇;張虹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紅河學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;G16B40/00
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種利用ISSR反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法，其特征在于，其步驟包括：

(1)DNA的提取：采集嫩葉用于全基因組DNA提取；

(2)采用ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)步驟(1)中提取的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后銀染檢測(cè)條帶；

(4)利用ISSR分子標(biāo)記引物體系將不同來(lái)源的草果進(jìn)行聚類及主坐標(biāo)分析；

(5)遺傳多樣性分析：計(jì)算草果實(shí)驗(yàn)材料遺傳多樣性參數(shù)；

ISSR-PCR反應(yīng)體系的ISSR分子標(biāo)記引物由UBC807、UBC809、UBC835、UBC836、UBC841、UBC842、UBC847、UBC862、UBC873、UBC885和UBC888組成；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.11所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的DNA的提取具體為：采用2×CTAB法提取DNA，并將提取的DNA樣品溶于TE緩沖液后存儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆茫瑪U(kuò)增前用雙蒸水將DNA樣品稀釋成20ng/μL的工作液，作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中ISSR-PCR反應(yīng)體系具體為：每25μL的反應(yīng)體系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶1.5U、Mg²⁺ 1.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.3μmol/L和模板DNA 50ng；將上述反應(yīng)混合液按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存；

退火溫度根據(jù)所選擇的引物來(lái)確定，具體如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后銀染檢測(cè)條帶，具體為：電泳結(jié)束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉(zhuǎn)入含有0.2％硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次1min，轉(zhuǎn)入含2％氫氧化鈉和0.4％甲醛的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉(zhuǎn)入蒸餾水中；在凝膠成像系統(tǒng)下對(duì)膠體進(jìn)行拍照保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中聚類分析及主坐標(biāo)分析具體為：讀取步驟(3)獲得的譜帶信息，將電泳圖譜上100～2000bp范圍內(nèi)清晰且重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣；統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)；用NTSYS-pc(2.10e)軟件中SimQual程序計(jì)算相似系數(shù)矩陣，以Clustering程序中SHAN進(jìn)行UPGMA聚類；用Tree plot模塊生成聚類圖，構(gòu)建分子進(jìn)化樹；根據(jù)計(jì)算的相似系數(shù)矩陣進(jìn)行Decenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中遺傳多樣性分析具體為：根據(jù)01二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占的比率(PPB)和引物多態(tài)性信息含量(PIC)，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量，f_i表示有帶所占的頻率，(1－f_i)表示無(wú)帶所占的頻率；對(duì)每條引物來(lái)說(shuō)，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)；對(duì)每條引物而言，標(biāo)記指數(shù)(MI)按下述公式計(jì)算：MI＝NPB×PIC；釆用POPGene32軟件對(duì)所有試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算：等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon's信息指數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)比率。