[發明專利]一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201710385500.5
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107227283B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 楊晟;蔣宇;錢峰慧;楊俊杰;程江紅;吳濤;胡丹;刁劉洋
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/04;C12R1/15
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明屬于微生物領域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。本發明所述谷氨酸棒桿菌其細胞內編碼6?磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸。本發明所述谷氨酸棒桿菌對戊糖磷酸途徑中的gnd基因進行點突變，使得6?磷酸葡糖酸脫氫酶的第361位的絲氨酸被苯丙氨酸替代，而減弱6?磷酸葡糖酸脫氫酶的變構調節，從而增強NADPH再生能力，為脯氨酸合成提供充足的NADPH，進而提高脯氨酸的產量。實驗表明本發明所述谷氨酸棒桿菌為L?脯氨酸高產菌株，能有效積累L?脯氨酸，提高L?脯氨酸的產量，為L?脯氨酸的工業化生產奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于微生物領域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用，尤其是涉及一種產L-脯氨酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用

背景技術

L-脯氨酸(L-proline)，化學名稱為L-吡咯烷酮羧酸，分子式為C₅H₉NO₂，相對分子質量為115。脯氨酸是構成蛋白質的基本單位，是組成人體蛋白質的21種氨基酸之一。脯氨酸廣泛應用于醫藥、食品及調味劑、農業和有機化學。作為氨基酸類藥物，脯氨酸是復方氨基酸大輸液原料之一，用于營養不良、蛋白質缺乏癥、嚴重胃腸道疾病，燙傷及外科手術后的蛋白質補充。脯氨酸可以調節細胞的滲透壓，穩定蛋白的結構。隨著研究不斷深入，脯氨酸的應用范圍也進一步擴大。因此，脯氨酸的生產具有非常廣泛的應用前景。

目前，L-脯氨酸的生產方法有三種：化學合成法、酶解法、微生物發酵法。化學合成法和酶解法由于原料來源受限制、生產成本高、污染環境，難以實現大規模工業化生產。微生物發酵法具有原料成本低、反應條件溫和、容易實現大規模生產等優點，成為目前生產L-脯氨酸主流方法。

棒桿菌是用于生產L-氨基酸的代表性微生物，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophlum)和黃色短桿菌(Breviabacterium flavum)。為了改善這些微生物的L-脯氨酸生產能力，可以通過傳統誘變進行菌株選育，以解除代謝調節中的反饋抑制和阻遏，達到過量積累L-脯氨酸的目的。以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)2247為出發菌，吉永獲得了一株L-異亮氨酸缺陷型變異株NO.14-5，經72小時培養可生成1.2％-1.5％的脯氨酸。張偉國以嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophlum)ATCC 13870為出發菌株，經亞硝基胍(NTG)誘變處理及結構類似物定向選育，獲得了一株L-脯氨酸高產菌ZQ-3，在含16％葡萄糖的培養基中，搖瓶發酵72h，產酸率為5.4％。但目前L-脯氨酸的菌種的發酵性能仍較差、L-脯氨酸的轉化率仍較低，仍不能滿足大規模工業化生產的需求。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術存在的缺陷，提供一種L-脯氨酸產量高的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種谷氨酸棒桿菌，其細胞內編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸。

6-磷酸葡糖酸脫氫酶是戊糖磷酸途徑中產NADPH的關鍵酶之一。本發明對戊糖磷酸途徑中的gnd基因進行點突變，使得6-磷酸葡糖酸脫氫酶的第361位的絲氨酸被苯丙氨酸替代，而減弱6-磷酸葡糖酸脫氫酶的變構調節，從而增強NADPH再生能力，為脯氨酸合成提供充足的NADPH，進而提高脯氨酸的產量。所述谷氨酸棒桿菌通過使用gnd基因而被修飾使得所述菌株的產生L-脯氨酸的能力與所述谷氨酸棒桿菌的未修飾的菌株相比增強。

在一個實施方案中，本發明提供了一種谷氨酸棒桿菌MHZ-0701，其細胞內gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.13757。