[發(fā)明專利]一種谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710385500.5
• 申請(qǐng)日: 2017-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN107227283B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊晟;蔣宇;錢峰慧;楊俊杰;程江紅;吳濤;胡丹;刁劉洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P13/04;C12R1/15
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

1.一種具有產(chǎn)生L-脯氨酸的能力的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，所述菌株的gnd基因的第361位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼幔凰龉劝彼岚魲U菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13757。

2.權(quán)利要求1所述谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

步驟A、構(gòu)建含有編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬耐蛔兓虻?重組質(zhì)粒；

步驟B、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷酸棒桿菌MHZ-0700，用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，將篩得的轉(zhuǎn)化子用液體腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)；所述谷酸棒桿菌MHZ-0700的保藏編號(hào)為CGMCC No.13756；

步驟C、培養(yǎng)物稀釋后涂布在含有10％蔗糖的固體腦心浸液培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得重組菌株；

其中，步驟A所述構(gòu)建含有 編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬耐蛔兓虻?重組質(zhì)粒的方法具體包括以下步驟：

1)以ATCC13870基因組為模板，以gnd-1f/gnd-1r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到上游片段gnd³⁶¹-up；以ATCC13870基因組為模板，以如表1所示的gnd-2f/gnd-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到下游片段gnd³⁶¹-dn；

表1引物序列

引物	核苷酸序列	SEQ ID NO：
gnd-1f	actgaattcaagatggtccacaacggcatcga	1
gnd-1r	agttgttctcgtcgaagccagccttgatc	2
gnd-2f	gatcaaggctggcttcgacgagaacaact	3
gnd-2r	cgcggatcctatcgacgcccacctccggcgaa	4

2)以gnd³⁶¹-up、gnd³⁶¹-dn兩片段混合物為模板，以gnd-1f/gnd-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變的gnd³⁶¹片段；

3)將gnd³⁶¹片段和pK18mobsacB載體分別用EcoRI、BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物以T4DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-gnd³⁶¹。