[發明專利]一種基于SRAP標記的草果種質資源遺傳多樣性分析方法

有效

• 申請號: 201710384549.9
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107099599B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 盧丙越;馬孟莉;孟衡玲;王田濤;雷恩;李春燕;張虹;張薇;蘇一蘭;劉艷紅;袁盛勇
• 申請（專利權）人: 紅河學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11;G16B40/00;G16B30/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種用于草果遺傳多樣性分析的SRAP分子標記引物體系，其特征在于，包括12對引物，分別是：

me1-em11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.20所示；

和me1-em12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.21所示；

和me1-em15，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.24所示；

和me2-em11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20所示；

和me2-em12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.21所示；

和me5-em5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14所示；

和me5-em6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.15所示；

和me6-em2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11所示；

和me6-em5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14所示；

和me6-em14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.23所示；

和me9-em6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.15所示；

和me9-em11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.20所示。

2.一種利用SRAP分子標記分析草果遺傳多樣性的方法，其特征在于，其步驟包括：

(1)采用2*CTAB法提取草果基因組DNA以備用；

(2)采用SRAP-PCR反應體系對步驟(1)中提取的DNA樣品進行擴增，每25μL的反應體系中含有不含Mg²⁺的10×PCRbuffer3.0μL、Taq酶1U、Mg²⁺1.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.2μmol/L和模板DNA 30ng；將上述反應混合液按如下程序進行擴增：95℃預變性5min，95℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存，所述引物選自權利要求1中的所述me1-em11、me1-em12、me1-em15、me2-em11、me2-em12、me5-em5、me5-em6、me6-em2、me6-em5、me6-em14、me9-em6或me9-em11中任一對；

(3)將PCR擴增產物在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳結束后銀染檢測條帶；

(4)草果遺傳多樣性分析：通過分析12對引物擴增所得的12條產物進行聚類及主坐標分析，并進行各遺傳多樣性參數的統計；讀取步驟(3)獲得的譜帶信息，將電泳圖譜上100～2000bp范圍內清晰且可重復出現的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣；統計每對引物擴增出的總條帶數和多態性條帶數；用NTSYS-pc(2.10e)軟件中SimQual程序計算相似系數矩陣，以Clustering程序中SHAN進行UPGMA聚類；用Tree plot模塊生成聚類圖，構建分子進化樹；根據計算的相似系數矩陣進行Decenter數據轉換，進而進行主坐標分析；

根據01二元數據矩陣，統計SRAP擴增產物的條帶總數和多態性條帶數(NPB)，計算多態性條帶所占的比率(PPB)和引物多態性信息含量(PIC)，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i個位點的多態性信息含量，f_i表示有帶所占的頻率，(1－f_i)表示無帶所占的頻率；對每對引物來說，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每對引物的多態性條帶數；對每個引物組合而言，標記指數(MI)可以按下述公式計算：MI＝NPB*PIC；采用POPGene32軟件對所有試驗材料進行遺傳多樣性參數計算：等位基因數、有效等位基因數、Shannon's信息指數、基因多樣性指數和多態位點比率。