[發(fā)明專利]皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710384209.6
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN107058252A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬琨;劉智禹;方春華;陳貝;潘南;蔡水淋;許旻;劉淑集
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N15/81;A23K20/189;A23L33/10;A61K38/44;A61P39/06;A61K8/65;A61Q19/08;C12R1/84
• 代理公司: 北京格旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11443
• 代理人: 雒純丹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶及其編碼的基因與應(yīng)用，特別涉及一種皺紋盤鮑的基因工程表達(dá)，具體涉及一種皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶(TPX)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

硫氧還蛋白過氧化酶(thioredoxinperoxidase，TPX)是過氧化物還原酶家族的一員，是過氧化物酶超家族的新成員，廣泛存在于自然界中，能夠清除體內(nèi)的多種自由基，維持體內(nèi)環(huán)境平衡。硫氧還蛋白過氧化酶中TPX1、TPX2、TPX6均位于胞漿中；TPX3存在于線粒體；TPX4位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)；TPX5則分布在過氧化物酶體內(nèi)。其含有一個(gè)或者二個(gè)半胱氨酸殘基，其主要分為六種類型：前五種同工酶均含有二個(gè)半胱氨酸殘基，第六種同工酶則含有一個(gè)半胱氨酸殘基。具有相同數(shù)量的半胱氨酸殘基，它們的同源性較高。在體內(nèi)參與細(xì)胞的許多生理生化反應(yīng)：作為細(xì)胞傳遞的信號(hào)、對細(xì)胞增殖和分化起調(diào)控作用等。而且由于TPX2天然的抗氧化性能，可用于開發(fā)抗氧化性食品、醫(yī)藥制備等領(lǐng)域。

皺紋盤鮑(H.discus hannai Ino)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)，以其豐富的營養(yǎng)價(jià)值在民間一直被認(rèn)為是與魚翅、燕窩齊名的營養(yǎng)食品。目前，已有的對鮑藥用及食用價(jià)值的研究主要集中在多肽與多糖的提取制備及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活環(huán)境和代謝方式，體內(nèi)存在許多具有藥用價(jià)值的特殊生理活性物質(zhì)，是開發(fā)新型海洋藥物和功能食品的重要資源。福建省皺紋盤鮑資源豐富、產(chǎn)量大，至2013年，鮑產(chǎn)量達(dá)到88470t，所占比例超過全國產(chǎn)量的80％。鮑產(chǎn)業(yè)已成為福建省海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是水產(chǎn)業(yè)增長速度最快、經(jīng)濟(jì)效益最好的產(chǎn)業(yè)。如何充分高效地利用鮑資源，挖掘其中的生物活性物質(zhì)往保健食品和海洋藥物方向高值化利用，符合我省和我國當(dāng)今新興的海洋戰(zhàn)略發(fā)展研究。

對于硫氧還蛋白過氧化酶的直接分離提取工藝相對復(fù)雜；而化學(xué)合成成本過高且難以保持其天然結(jié)構(gòu)?；蚬こ桃约暗鞍踪|(zhì)工程的應(yīng)用為獲得天然活性肽開辟了有效途徑。基因工程制備生物活性肽克服了直接從動(dòng)、植物原料中提取抗氧化蛋白篩選的盲目性，純化工藝簡單，便于規(guī)?；a(chǎn)，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶Hdh TPX2的制備方法以其在制備食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種編碼皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶的基因，含有SEQ ID NO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硫氧還蛋白過氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的基因，其中用于所述基因擴(kuò)增的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶，含有以上所述的編碼超氧化物歧化酶的基因所編碼。

第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶基因的載體，所述載體為含有以上所述的硫氧還蛋白過氧化酶基因、AOX1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)以及篩選標(biāo)志的畢赤酵母表達(dá)載體，所述畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC9K。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的載體，所述硫氧還蛋白過氧化酶基因位于畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)處SnaB Ⅰ和Not Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間。

優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的載體，所述篩選標(biāo)志為6×His-tag標(biāo)簽。

本發(fā)明還提供了一種皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶制備方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建含有編碼皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶的基因的重組表達(dá)載體；

(2)將步驟(1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可表達(dá)皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶的基因工程菌菌株；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；

(4)分離純化步驟(3)所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶；

其中，步驟(1)中所述編碼皺紋盤鮑硫氧還蛋白過氧化酶的基因，含有SEQ ID NO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：