[發(fā)明專(zhuān)利]一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710383874.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107338234B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江正強(qiáng);閆巧娟;孫倩;耿芳;龔思怡
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/58
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81;A23J3/34;A23L13/70
• 代理公司: 北京衛(wèi)平智業(yè)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11392
• 代理人: 董琪

本發(fā)明公開(kāi)了一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用，具體涉及重組天冬氨酸蛋白酶、編碼基因及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。該重組天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，所述重組天冬氨酸蛋白酶的編碼基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。將米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因RmproA連接至巴斯德畢赤酵母GS115表達(dá)載體pPIC9K，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)得到重組天冬氨酸蛋白酶。經(jīng)5L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后，重組菌株在156h時(shí)最高產(chǎn)蛋白酶活力為3400U/mL，蛋白含量為6.42mg/mL。本發(fā)明提供的重組天冬氨酸蛋白酶能有效嫩化豬肉，降低剪切力，使肉質(zhì)適口，能夠有效水解動(dòng)物及植物蛋白，制備低分子量多肽。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白酶(Protease，EC 3.4)是一類(lèi)催化蛋白質(zhì)水解生成多肽和氨基酸的酶，在生物體中發(fā)揮著不同的生理功能。蛋白酶來(lái)源豐富，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中。通過(guò)天然篩選和基因工程等手段獲得的蛋白酶具有不同的特性，已應(yīng)用于食品、制革、飼料和洗滌等多個(gè)領(lǐng)域。

天冬氨酸蛋白酶是具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的一類(lèi)蛋白酶，在奶酪制造、調(diào)味料生產(chǎn)、酪蛋白水解物制備、肉類(lèi)嫩化及多肽制備等中都有應(yīng)用。大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶在酸性pH條件下表現(xiàn)出較高活性，又被稱(chēng)為酸性蛋白酶。已報(bào)道的產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株主要有曲霉屬的黑曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等。根毛霉屬和毛霉屬也是產(chǎn)酸性蛋白酶的優(yōu)良菌株，已被廣泛應(yīng)用于商業(yè)凝乳酶制劑的制備。目前，國(guó)內(nèi)研究較多的是米黑毛霉所產(chǎn)的凝乳酶，經(jīng)紫外誘變后的米黑毛霉所產(chǎn)的凝乳酶活力達(dá)到2703 SU/mL(李學(xué)朋,關(guān)明玲,馮瑞章等.產(chǎn)凝乳酶米黑毛霉的誘變育種研究.食品工業(yè)科技,2015,36:137-141)。李學(xué)朋等人優(yōu)化了米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的固體發(fā)酵條件，產(chǎn)酶活力最高達(dá)3649 SU/mL(李學(xué)朋,師希雄,馮瑞章等.米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化.食品工業(yè)科技,2014,7:130-134)。此外，米黑毛霉一個(gè)天冬氨酸蛋白酶基因已在卷枝毛霉中成功表達(dá)(Dickinson L.,Harboe M.,Heeswijck R.V.,Stroman P.,Jepsen L.P.Expression of active Mucor mieheiaspartic protease in Mucor circinelloides.Carlsberg Research Communicaions,1987,52,243-252)。有專(zhuān)利報(bào)道利用米黑毛霉生產(chǎn)凝乳酶方法(專(zhuān)利號(hào)為201310472404.6，申請(qǐng)日期2013.10.11)，采用米黑毛霉ATCC16457發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶，添加硫酸鹽和還原糖發(fā)酵時(shí)酶活力最高為410IMCU/mL。