[發明專利]一種新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生產方法及其應用

有效

• 申請號: 201710383874.3
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107338234B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 江正強;閆巧娟;孫倩;耿芳;龔思怡
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81;A23J3/34;A23L13/70
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙) 11392
• 代理人: 董琪

1.一種重組天冬氨酸蛋白酶，其特征在于：所述重組天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。

2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因。

3.如權利要求2所述蛋白質的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

4.一種重組質粒，其特征在于：所述重組質粒由權利要求2所述的編碼基因連接至巴斯德畢赤酵母GS115表達載體pPIC9K構建而成。

5.一種重組菌株，其特征在于：所述重組菌株是將權利要求4所述的重組質粒轉入巴斯德畢赤酵母中獲得的。

6.一種制備如權利要求1所述重組天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)種子液培養：將重組菌株接種于YPD培養基中，在30℃、220rpm條件下培養24h，得到種子液；

2)分批發酵培養：將步驟1)的種子液以10％接種量接種于5L發酵罐中的分批發酵培養基中進行培養，分批發酵培養基的裝液量為20-30％，攪拌轉速為500-600rpm，通氣量為1.0-2.0vvm，用25％氨水調節pH，控制pH 4.0-6.0，培養溫度為28-30℃；

3)甘油流加培養：當分批發酵培養基中的甘油耗盡溶氧反彈時以15-20mL/h/L的流速補加質量濃度為50％的甘油，待甘油再次耗盡溶氧反彈時，饑餓0.5-1.5h，開始流加誘導培養基；

4)甲醇誘導培養：將攪拌轉速升高至800-900rpm，誘導培養基采用分段流加方式：0-8h時流速為3.6mL/h/L，8h時流速為10.9mL/h/L，誘導重組天冬氨酸蛋白酶表達，得到發酵液；

5)離心和純化：將所述發酵液依次進行離心和純化。

7.如權利要求6所述制備重組天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述分批發酵培養基包括：CaSO₄ 0.93g，K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，85％磷酸26.7mL，PTM₁4.35mL/L；步驟3)中補加的甘油中含12mL/L PTM₁，所述誘導培養基是含有12mL/L PTM₁的100％甲醇誘導培養基。

8.如權利要求6所述的制備重組天冬氨酸蛋白酶的方法，其特征在于：所述離心和純化包括以下步驟：

(1)將發酵液在10000×g條件下冷凍離心10min，取上清液，所述上清液為含有重組天冬氨酸蛋白酶的溶液；

(2)將步驟(1)中含有重組天冬氨酸蛋白酶的溶液依次進行QSFF強陰離子交換層析和S-100凝膠過濾層析，得到純化后的重組天冬氨酸蛋白酶。

9.權利要求1所述重組天冬氨酸蛋白酶在嫩化豬肉和水解動物及植物蛋白制備多肽的應用。