[發明專利]RGDF靶向的新型釕多吡啶配合物載體的制備和評價

在審

• 申請號: 201710382819.2
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107320731A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 崔純瑩;鐘榮榮
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: A61K47/42
• 分類號: A61K47/42;A61K48/00;C07F15/00;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙)11130
• 代理人: 王為,孟旭

1.一種具有靶向性的基因載體，Ru-CO-RGDF。

2.權利要求1所述基因載體Ru-CO-RGDF的制備方法，包括以下步驟：合成4’-甲基-2,2’-聯吡啶-4-甲酸與H-R(Tos)-G-D(OBzl)-F-OBzl通過DCC/HoBt法縮合后，再經過強酸脫保護，最后與雙(2,2’-聯吡啶)二氯化釕縮合，即得。

3.一種基因遞送系統，其特征在于，由基因載體Ru-CO-RGDF和抗腫瘤基因治療藥物survivin-siRNA制備而成。

4.權利要求3所述的基因遞送系統，其特征在于，基因載體Ru-CO-RGDF和抗腫瘤基因治療藥物survivin-siRNA的重量比為1.66:1。

5.權利要求3所述的基因遞送系統，為納米結構。

6.權利要求3所述的基因遞送系統的制備方法，包括以下步驟：基因載體Ru-CO-RGDF與魚精蛋白在常溫下混合，靜置待用，取抗腫瘤基因survivin-siRNA與DNA在常溫下混合，室溫待用，將上述兩者溶液混合后，即得Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA。

7.權利要求3所述的基因遞送系統的制備方法，其特征在于，Ru-CO-RGDF由以下方法制備而成：4’-甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-羧酸與H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl在THF與少量DMF中通過DDC/HOBt反應，然后再脫掉保護基團，最后與順式-雙(2,2'-聯吡啶)二氯化釕在加熱回流，氮氣保護下反應8小時得到Ru-CO-RGDF。

8.權利要求3所述的基因遞送系統的制備方法，其特征在于，Ru-CO-RGDF由以下方法制備而成:

1)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的合成

精氨酸和天冬氨酸主鏈用Boc保護氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用OBzl保護羧基端，側鏈用適宜的保護基(叔丁氧羰基)保護的L-氨基酸，液相法接肽，得到兩個全保護的二肽:Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl和Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。分別用氫解方法脫去OBzl保護和酸解方法脫去Boc保護后，繼續用液相法接肽，得到全保護四肽。在冰浴的條件下，用溶有HCl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mg Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，攪拌反應，用TLC板監測反應。等反應結束后，抽氣，將酸氣抽干。即得H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。

2)合成4’-甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

將28mg4’-甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-羧酸與117mg H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl用液相法接肽，制得124mg全保護的中間體4’甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。

3)合成4’-甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-酰基-RGDF

用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反應30分鐘，加入冰乙醚終止反應后離心，用冰乙醚將產物洗至接近中性，脫去保護基，最終得到目標產物4’-甲基-(2,2’-聯吡啶)-4-酰基-RGDF。

4)Ru-CO-RGDF的合成

順式-雙(2,2'-聯吡啶)二氯化釕(48毫克，0.09毫摩爾)和混合物4'-甲基-2,2'-聯吡啶-4-酰基-RGDF(56毫克，0.08毫摩爾)在乙醇(10mL)和水的混合物中于黑暗中和在氮氣保護下回流進行8小時。將反應混合物通過旋轉蒸發儀進行蒸發，后將殘余物溶解在5mL水中，向其中加入2毫升飽和NH4PF6，會形成磚紅色沉淀，離心后收集沉淀。通過過濾，用水洗滌，并真空干燥后得到一種紅橙色粉末。將粉末溶解在2毫升甲醇中，溶液進行過濾，將濾液在真空下蒸發，并將殘余物重結晶在甲醇和乙醚的混合溶劑中，并通過C18進行簡單分純，得到50毫克的復雜的Ru-CO-RGDF的六氟磷酸鹽,

將終產物溶于較少的乙腈中，加入丙酮溶解的四丁基氯化銨溶液，有磚紅色沉淀析出，離心后收集沉淀，干燥，得到氯代的終產物Ru-CO-RGDF。