[發(fā)明專利]鑒定和定量低頻體細(xì)胞突變的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710381726.8
• 申請(qǐng)日: 2017-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN108949911B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏麗萍;趙博洵;黃岳;伍啟熹;葉永鑫;鄭夏寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6827
• 分類號(hào): C12Q1/6827
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;盧蓓

本發(fā)明提供了鑒定和定量低頻體細(xì)胞突變的方法，特別涉及鑒定轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)和基因組定位的方法。本發(fā)明利用不同轉(zhuǎn)座子家族的特異位點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)特異性地富集轉(zhuǎn)座子插入序列，利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，精準(zhǔn)的鑒定樣本中轉(zhuǎn)座子的基因組定位、拷貝數(shù)和類型。使用本發(fā)明的方法能夠經(jīng)濟(jì)地、精準(zhǔn)地鑒定轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)和基因組定位。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開內(nèi)容涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域。特別地，本公開內(nèi)容涉及對(duì)基因組中低頻突變的鑒定和檢測(cè)，例如對(duì)轉(zhuǎn)座子新發(fā)插入事件的檢測(cè)。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)座子(Transposon)也稱為轉(zhuǎn)座元件(Transposable element)，是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。除了在基因組中大量存在以外，轉(zhuǎn)座子在個(gè)體中能夠以一定頻率將其自身序列復(fù)制或轉(zhuǎn)移到新的基因組位點(diǎn)。這種轉(zhuǎn)座事件可能影響表型。例如，導(dǎo)致功能基因被破壞的轉(zhuǎn)座事件可能導(dǎo)致疾病(特別是與該功能基因相關(guān)的單基因病)。因此，對(duì)轉(zhuǎn)座事件的鑒定對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)制研究、遺傳咨詢、診斷和預(yù)后具有重要的臨床意義。

根據(jù)轉(zhuǎn)座的性質(zhì)，轉(zhuǎn)座子通常可分為兩類。第一類轉(zhuǎn)座子稱為DNA轉(zhuǎn)座子(DNAtransposon)，以剪切-粘貼方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。該類轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座后，基因組中轉(zhuǎn)座子的總拷貝數(shù)不變。第二類轉(zhuǎn)座子稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Retrotransposon)，以復(fù)制-粘貼方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。它首先轉(zhuǎn)錄合成mRNA，之后再次插入基因組反轉(zhuǎn)錄回DNA，完成轉(zhuǎn)座過(guò)程。這意味著，每發(fā)生一次轉(zhuǎn)座，基因組中該轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)就會(huì)增加1份。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又可分類兩類：LTR型和非LTR型，前者的末端具有長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR，long terminal repeat)，而后者不具有這一結(jié)構(gòu)特征。

根據(jù)轉(zhuǎn)座的自主性，轉(zhuǎn)座元件又可以分為自主轉(zhuǎn)座元件和非自主轉(zhuǎn)座元件，前者能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進(jìn)行轉(zhuǎn)座，例如L1NE-1轉(zhuǎn)座子家族。后者則需在自主轉(zhuǎn)座元件存在時(shí)，通過(guò)劫持轉(zhuǎn)座酶完成轉(zhuǎn)座，例如Alu和SVA轉(zhuǎn)座子家族。

LINE-1(Long INterspersed Element-1)，或簡(jiǎn)稱L1，是哺乳動(dòng)物中主要的轉(zhuǎn)座子，也是人類中唯一活躍的自主轉(zhuǎn)座元件類別。LINE-1是非LTR型反轉(zhuǎn)座子，長(zhǎng)度約為6kb。在人類基因組中有超過(guò)500,000個(gè)拷貝的LINE-1序列，但其中絕大多數(shù)是不活躍的，只有約80-100個(gè)全長(zhǎng)L1會(huì)活躍地發(fā)生轉(zhuǎn)座。

LINE-1的轉(zhuǎn)座事件分為兩種：生殖系插入(Germline insertion)事件和體細(xì)胞插入(Somatic insertion)事件。前者在親代生殖系細(xì)胞中就已發(fā)生，因此存在于子代個(gè)體的所有細(xì)胞中。相反，體細(xì)胞插入事件發(fā)生于合子形成后，從早期胚胎發(fā)育至終末分化成熟階段的體細(xì)胞中，因此只存在于個(gè)體的少數(shù)細(xì)胞中。因此，體細(xì)胞插入事件也稱為新發(fā)插入(denovo insertion)或細(xì)胞特異性插入(Cell-specific insertion)。在人體中，新發(fā)體細(xì)胞突變的發(fā)生頻率很低，但卻能夠?qū)е露喾N疾病的發(fā)生，例如癌癥、增生疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此，對(duì)新發(fā)插入事件的檢測(cè)具有重要的意義。

目前，新發(fā)轉(zhuǎn)座事件的鑒定在技術(shù)上還存在很多困難。

首先，新發(fā)插入事件無(wú)序列特異性。新發(fā)插入的轉(zhuǎn)座子與基因組中固有的轉(zhuǎn)座子在基因序列上沒(méi)有差異，導(dǎo)致無(wú)法通過(guò)對(duì)序列本身的鑒定將二者相區(qū)分。

其次，檢測(cè)背景極高。如上文所述，在單個(gè)細(xì)胞的基因組中，基因組中轉(zhuǎn)座子序列是大量存在的，而新發(fā)插入事件在所有轉(zhuǎn)座子序列中僅占極小的比例。換言之，在對(duì)新發(fā)插入進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，必須從基因組中極高的固有轉(zhuǎn)座子背景中將新發(fā)事件識(shí)別出來(lái)。同時(shí)，在一份組織樣品中，可能只有少數(shù)細(xì)胞帶有特定插入這意味著，樣品中新發(fā)插入事件的信號(hào)又會(huì)降低二至三個(gè)數(shù)量級(jí)。而且，由于新發(fā)插入事件的發(fā)生頻率很低，就必須對(duì)極大數(shù)量的細(xì)胞群進(jìn)行測(cè)序，才能確保在取樣的樣品中包含含有新發(fā)插入的細(xì)胞。也就是說(shuō)，不可能通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序來(lái)排除樣品中大量參照細(xì)胞的干擾。總之，對(duì)新發(fā)插入事件的檢測(cè)方法必須有效排除大量其他細(xì)胞的高背景噪音以及含有新發(fā)插入細(xì)胞本身的固有轉(zhuǎn)座子序列帶來(lái)的高背景噪音。