[發明專利]一種采用載體吸附進行黑曲霉孢子增殖及其干孢子粉的制備方法

在審

• 申請號: 201710381711.1
• 申請日: 2017-05-26
• 公開（公告）號: CN107058209A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 王德培;黃娟
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N11/02;C12R1/685
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種多孔載體吸附黑曲霉孢子增殖的方法以及一種黑曲霉孢子粉的干燥復合保護劑及干燥方法。

背景技術

在工業發酵領域，菌種的擴大培養是發酵工藝的重要環節。黑曲霉是極其重要的工業微生物，是許多發酵產品的生產菌，特別是有機酸、酶制劑、抗生素等行業，用來生產檸檬酸、蘋果酸、沒食子酸、衣康酸、蘋果酸等有機酸，還可以用于生產糖化酶、酸性蛋白酶和果膠酶等30種以上的酶制劑，僅我國標準規定的黑曲霉來源的食品用酶制劑就有26種之多。黑曲霉還可用于禽畜的糞便、有機垃圾、生物肥料、秸稈腐熟等發酵時添加。

應用黑曲霉生產各類產品過程中，主要以黑曲霉孢子進行接種發酵。因為黑曲霉孢子具有易貯藏、保藏費用低、可便于運輸、不易污染、環境適應性強、直接投入發酵、發酵再生能力強等優勢。在實際生產中一般將黑曲霉菌孢子接種于待發酵物料，因此研制黑曲霉孢子粉具有較好的生產應用價值。

黑曲霉檸檬酸深層發酵，需要用大量的黑曲霉孢子接種，工業上一般利用2L的三角瓶采用靜置扣瓶法固體發酵制備的麩曲孢子。由于孢子增殖時間較長，麩曲皮的營養不足夠支撐孢子的萌發增殖的這個過程，導致產生的黑曲霉孢子的質量不高且易退化。而且在孢子增殖過程中需要大量氧氣，麩曲瓶靜置培養造成供氧不足，產生的孢子質量不穩定，并且每瓶最多收獲孢子數量僅在10¹¹CFU/瓶，導致50噸種子罐需要接種100-110瓶，為大規模工業化生產帶來沉重負擔。所以需對孢子增殖方式進行優化，以得到高數量、高質量的黑曲霉孢子進行接種發酵。

干燥工藝是制備微生態制劑的關鍵，菌體存活率及活性是確定菌體最佳干燥工藝和最佳保護劑配方的指標。干燥對微生物細胞的影響主要是對細胞膜和敏感蛋白質的損傷。干燥過程中會造成細胞膜通透性改變、膜的性質、結構和功能改變、蛋白質變性失活、pH的動態平衡被破壞、DNA損傷和膜脂肪酸組成發生改變等。

研究表明，在干燥前加入適當的保護劑可以改變菌體干燥時的物理、化學環境，減輕或防止干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特征和生物活性，從而提高微生物干燥過程中的存活率，延長菌種貯存期。目前廣泛采用的保護劑有海藻糖、脫脂奶粉、蔗糖、甘油、吐溫、谷氨酸鈉等。而實際上，保護劑的作用會隨菌株種類的不同，保護劑的種類及配比表現的一定的差異。因此，需找到最佳的干燥方法及保護劑配方以減少干燥過程對微生物細胞的影響。保護劑對微生物干燥效果的影響很大，保護劑的選擇是最為關鍵的一步。

冷凍干燥是目前大多數微生物干燥的主要方法。但是大量研究顯示,微生物胞內多數酶類在凍干過程中會受到較大影響,但目前尚未有較好的方法來防止這些酶在凍干時發生活性的改變。另一方面,冷凍干燥同時有許多不足: 凍干過程操作復雜、儀器成本高、干燥時間長、工藝條件較為茍刻, 影響了微生態制劑工業化、商品化進程。相比而言,室溫干燥法消耗能源少、工藝簡單、成本低廉，更適于大型生產。

發明內容

本發明改變了工業上采用2L的三角瓶靜置培養，固體發酵制備麩曲孢子的方法。通過對孢子增殖方式進行優化，得到高數量、高質量的黑曲霉干孢子粉。

為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：

本發明研究過程中所用黑曲霉為CMCC2450 是公知的菌株。

一種采用載體吸附進行黑曲霉孢子增殖的制備方法，其特征在于將一定比例的玉米與麩皮混合，然后高溫淀粉酶液化，過濾，加入粉碎的玉米軸顆粒混合，滅菌，接種黑曲霉孢子，固態發酵罐培養，洗脫孢子懸液后加入復合保護劑，孢子懸液與復合保護劑體積比為2∶3，平衡時間為40 min，最后真空干燥，收集黑曲霉干孢子粉；且按如下的步驟進行；

固態發酵罐37℃培養120h→洗脫孢子→加入保護劑→平衡40分鐘→35℃真空干燥16h→收集干孢子。

（1）黑曲霉孢子增殖培養液的制備：

將玉米和麩皮按重量比為7:3的比例混合，按照固形物總重量與水的體積比為1:5，將玉米麩皮與水混合，按玉米重量每克12個單位將高溫淀粉酶加入到上述混合物中液化，100℃煮沸30分鐘，過濾，濾液定溶到原加水體積，即獲得黑曲霉孢子的培養液；

（2）固態發酵罐載體增殖黑曲霉孢子培養的制備：