[發(fā)明專利]一種飼養(yǎng)層細胞、培養(yǎng)方法及應用

有效

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• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107236703B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 趙姝燦;陳志勝;李東升;張曉芳;鄭桂純
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 王國標

本發(fā)明提供了一種飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)方法，包括步驟：1)雞骨髓間充質干細胞的獲取；2)飼養(yǎng)層的制備。本發(fā)明打破了傳統(tǒng)的以成纖維細胞作為飼養(yǎng)層的傳統(tǒng)方法，避免了多次制備不同代次的成纖維細胞造成的不確定性與不穩(wěn)定性；避免了異源細胞作為飼養(yǎng)層后產(chǎn)生的不利影響；所使用的細胞仍保持在早期胚胎期其擴增能力強和生存周期長；簡化了實驗操作步驟，節(jié)省了時間，降低實驗成本。

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種飼養(yǎng)層細胞、培養(yǎng)方法及應用。

背景技術

原始生殖細胞(Primordial Germ Cells，PGCs)具備發(fā)育全能性,因數(shù)量較多,可作為組織工程的新來源。它也是研究基因組印跡與胚胎早期發(fā)育關系的最佳材料,還是研究生殖細胞發(fā)育分化的體外模型、生產(chǎn)治療用重組蛋白的理想來源和研究轉基因動物遺傳操作的有效載體。雞胚原始生殖細胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)應用研究廣泛,相比較桑椹胚和囊胚體外培養(yǎng)獲取干細胞優(yōu)勢明顯；為基礎研究提供了最原始的發(fā)育生物學模型；生產(chǎn)克隆動物,降低禽類的保種成本；生產(chǎn)藥物蛋白,是生產(chǎn)治療用重組蛋白極為理想的來源。目前cPGC無飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)體系尚不完善，飼養(yǎng)層仍然是cPGC體外培養(yǎng)和大量擴增必不可少的因素，因此尋找能有效維持雞原始生殖細胞未分化生長狀態(tài)的飼養(yǎng)層細胞成為一個重要課題。

在cPGCs的體外培養(yǎng)中所采用的飼養(yǎng)層主要有STO細胞株、雞胚胎原代成纖維細胞(PCEF)、性腺基質細胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纖維細胞(PMEF)等。成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下存活時間較為有限，一般傳至5、6代時便開始衰老，這就決定了必須頻繁的進行成纖維細胞的制備，而不同批次制備的飼養(yǎng)層細胞增加了cPGCs培養(yǎng)過程中的不確定性和不穩(wěn)定性，不利于維持cPGCs的未分化狀態(tài)。以鼠源細胞作為飼養(yǎng)層時，異源性成分存在未知病原體感染的風險。

發(fā)明內容

為了克服現(xiàn)有的飼養(yǎng)層細胞不確定性及不穩(wěn)定性高，或可能存在未知病原體感染風險的問題，可使用與cPGCs相同來源的雞骨髓間充質干細胞(Chicken Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cells，cBM-MSC)作為cPGCs的飼養(yǎng)層細胞。因為間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)通過對Ⅱ型組織相容性復合基因MHC-II和其他共刺激分子的低表達，以主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)身份在供體和受體之間抑制T細胞的活動。通過這種機制，免疫排斥問題在使用同種異體MSC時顯得并不特別重要。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)雞骨髓間充質干細胞的獲取：取1至10天齡的雞的股骨和脛骨，以KO-DMEM培養(yǎng)基沖洗出骨內的骨髓細胞，過篩網(wǎng)制成單細胞懸液，將單細胞懸液放入離心管進行離心，隨后棄去上層脂肪等雜質后添加cBM-MSC完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

2)飼養(yǎng)層的制備：將雞骨髓間充質干細胞用含有0.02％EDTA的0.25％濃度的胰蛋白酶進行消化，調整細胞密度為5×10⁵個/mL，注入24孔板制成飼養(yǎng)層，待長成80％-90％匯合時，用絲裂霉素-C消化處理后進行離心，離心后再次調整細胞密度為5×10⁵個/mL，隨后接種于培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中以37℃，5％CO₂的環(huán)境條件培養(yǎng)至少24h。

其中，所述cBM-MSC培養(yǎng)基成分包括：KO-DMEM，胎牛血清，谷氨酰胺，谷丙氨酸二肽，表皮生長因子bFGF和雙抗溶液。