[發明專利]一種飼養層細胞、培養方法及應用

有效

• 申請號: 201710380719.6
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107236703B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 趙姝燦;陳志勝;李東升;張曉芳;鄭桂純
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 王國標

1.一種雞胚原始生殖細胞的體外培養方法，其特征在于，包括步驟：

從雞的14-16 HH階段胚胎的脈管系統中分離包含雞胚原始生殖細胞的血液組織，并加入含有飼養層細胞的培養皿中，添加cPGCs完全培養基進行培養；

所述飼養層細胞的制備方法包括：取1至10天齡的雞的股骨和脛骨，以KO-DMEM培養基沖洗出骨內的骨髓細胞，過篩網制成單細胞懸液，將單細胞懸液放入離心管，以1000rpm/min離心5min，棄去上層雜質后，收集底部細胞，添加cBM-MSC完全培養基進行培養，獲取雞骨髓間充質干細胞；

所述cBM-MSC完全培養基的成分包括：KO-DMEM，胎牛血清，谷氨酰胺，谷丙氨酸二肽，表皮生長因子bFGF和雙抗溶液；將雞骨髓間充質干細胞用含有0.02％EDTA的0.25％濃度的胰蛋白酶進行消化，調整細胞密度為5×10⁵個/mL，注入24孔板，待長成80％-90％匯合時，用絲裂霉素-C消化處理后進行離心，離心后再次調整細胞密度為5×10⁵個/mL，隨后接種于培養皿中，置于培養箱中以37℃，5％CO₂的環境條件培養至少24h，制成飼養層細胞；

所述cPGCs完全培養基的成分包括：7.5％胎牛血清、2.5%雞血清、2mM GlutaMAX-I，1×的核苷，1×的非必需氨基酸，100×的β-巰基乙醇，以及5ng/ml人LIF、5ng/ml人SCF和10ng/ml人bFGF，余量由KO-DMEM培養基補全。