[發(fā)明專利]一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器及其制備與應用

有效

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• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107254550B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 顏玉蓉;丁世家;程偉;楊建儒;刁瑋;程文彬;晏小玉;馬洪敏
• 申請（專利權）人: 重慶醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/682;C12R1/93
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

本發(fā)明提供一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器及其制備與應用，SPR傳感器的制備包括熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系的制備：（a）探針準備：采用DNA單鏈P、R、Q制備三鏈復合產(chǎn)物PRQ；（b）取步驟（a）所得三鏈復合產(chǎn)物PRQ，將雜交液、三鏈復合產(chǎn)物PRQ、單鏈F、靶序列T混合，孵育，得反應液；（c）將捕獲探針固定至工作芯片表面，將工作芯片置入表面等離子共振儀中，將步驟（b）所得的反應液進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，制得熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系。本發(fā)明成功構建了可用于HIV相關基因的表面等離子共振傳感器及檢測體系，應用本發(fā)明的傳感器對HIV相關基因的測定，靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。

技術領域

本發(fā)明涉及核酸檢測及表面等離子共振傳感領域，特別是涉及一種檢測HIV(人類免疫缺陷病毒)相關基因的SPR(表面等離子共振)傳感器及其制備與應用。

背景技術

自1985年中國大陸發(fā)現(xiàn)第1例HIV感染者至今，艾滋病(AIDS)在全球的流行日益嚴重，形勢嚴峻。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署數(shù)據(jù)，2015年全球共110萬人死于AIDS，該年新增艾滋病毒感染病例210萬。AIDS的流行給人類健康和社會經(jīng)濟帶來了極大的損害。人類免疫缺陷病毒(HIV)檢測的主要目的是診斷HIV病原體、指導臨床用藥以及檢出HIV攜帶者，早期的發(fā)現(xiàn)及干預有助于控制病情并及時阻斷傳播途徑。目前我國HIV感染的診斷大多是依賴血清學檢測，多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)聯(lián)合免疫印跡法(WB)檢測HIV抗體。雖然血清學檢測特異性好，適合于臨床及血液篩查等大樣本量的檢測，但其需要相應的儀器設備及接受過特殊培訓的技術人員。且由于技術原因，不能完全排除相互干擾的可能性，其靈敏度較差。另外，血清學檢測本身存在弊端：在“窗口期”病毒侵入但抗體還沒有產(chǎn)生，免疫學方法不能檢出，即使第四代ELISA檢測，仍有2-3周的窗口期，不能滿足早期診斷的需求。

因而，需要更早期的標志物用于HIV感染的診斷。在抗體產(chǎn)生之前，感染者體內(nèi)最早可被檢測到的是病毒核酸，且呈一過性高水平，此后有所下降。核酸檢測不依賴抗體的產(chǎn)生，可明顯縮短窗口期。核酸檢測具有以下特點：①能夠用于常規(guī)不能培養(yǎng)和分離的病毒的檢測(如HBV、HCV、HIV等)；②樣品用量少，并可檢測低豐度含量樣品；③不依賴抗體的產(chǎn)生，在病毒感染的急性期抗體尚未出現(xiàn)之前即可檢測，適用于早期診斷；④可對病毒基因進行基因分型，比血清分型更有價值；⑤通過對病毒耐藥基因的檢測，可預測或發(fā)現(xiàn)病毒的耐藥性；⑥可用于先天性或圍產(chǎn)期獲得性病毒感染的診斷；⑦靈敏度高(可達ng甚至fg水平，理論上能檢出單個病毒基因)，特異性好，快速、簡捷。

目前，核酸檢測主要是通過熒光定量PCR法，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，在線監(jiān)控反應過程，從而實現(xiàn)待檢核酸的實時定量檢測。將其運用于HIV病毒核酸檢測可以很好地解決“窗口期”漏診問題，只要病毒侵入就可以檢出，且特異性強、自動化程度高。但是該方法仍存在過程繁瑣，檢測時間長等不足之處。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器及其制備與應用，用于解決現(xiàn)有技術中對HIV的檢測特異性差、過程繁瑣、檢測時間長等問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明本發(fā)明第一方面提供一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器的制備方法，包括制備熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系，具體包括如下步驟：

(a)探針準備：將DNA單鏈P、R、Q溶解，混合，變性，制得三鏈復合產(chǎn)物PRQ，備用；

(b)取步驟(a)所得三鏈復合產(chǎn)物PRQ，將雜交液、三鏈復合產(chǎn)物PRQ與單鏈F、靶序列T混合，得混合液，孵育，反應，得反應產(chǎn)物；

(c)將步驟(b)所得的反應產(chǎn)物進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，制得所述熵驅(qū)動的鏈置換循環(huán)放大體系。

進一步地，步驟(a)中，所述單鏈P含有的核苷酸序列為：