[發明專利]一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器及其制備與應用

有效

• 申請號: 201710380620.6
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107254550B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 顏玉蓉;丁世家;程偉;楊建儒;刁瑋;程文彬;晏小玉;馬洪敏
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/682;C12R1/93
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

1.一種檢測HIV相關基因的SPR傳感器的制備方法，其特征在于：包括制備熵驅動的鏈置換循環放大體系，具體包括如下步驟：

(a)探針準備：將DNA單鏈P、單鏈R、單鏈Q溶解，混合，變性，制得三鏈復合產物PRQ，備用；

(b)取步驟(a)所得三鏈復合產物PRQ，將雜交液、三鏈復合產物PRQ、單鏈F、靶序列T混合，得混合液，孵育，得反應液；

(c)將捕獲探針固定至工作芯片表面，將所述工作芯片置入表面等離子共振儀中，將步驟(b)所得的反應液進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，制得熵驅動的鏈置換循環放大體系；

其中，步驟(a)中，所述單鏈Q上有4-8個堿基與捕獲探針互補配對，所述單鏈P的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述單鏈R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；步驟(b)中，所述單鏈F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述靶序列T的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；步驟(c)中，所述工作芯片上固定的捕獲探針序列如SEQ ID NO.1所示；

當所述單鏈Q上有4個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈Q的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

當所述單鏈Q上有5個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈Q的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

當所述單鏈Q上有6個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈Q的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

當所述單鏈Q上有7個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈Q的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；

當所述單鏈Q上有8個堿基與捕獲探針互補配對時，所述單鏈Q的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(a)中，混合液中單鏈P、R、Q的摩爾比為1.2:1.2:1；

和/或，步驟(a)中，先將DNA單鏈P、R、Q分別溶解于TE buffer中，再進行混合；

和/或，步驟(b)中，混合液中靶序列T的終濃度≥50fM；

和/或，步驟(b)中，孵育時間≥15min；

和/或，步驟(b)中，孵育溫度≥4℃；

和/或，步驟(b)中，先將DNA單鏈F、靶序列T分別溶解于TE buffer，再將雜交液與分別含有三鏈復合產物PRQ、單鏈F、靶序列T的TE buffer混合，得混合液，孵育，得反應液；

和/或，步驟(b)中，所述雜交液包括10mM Tris、480mM NaCl、5mM MgCl₂；

和/或，步驟(b)中，混合液中三鏈復合產物PRQ的終濃度為10nM；

和/或，步驟(b)中，混合液中單鏈F的終濃度為10nM；

和/或，步驟(b)中，靶序列T的加入體積為混合液總體積的2.5％；

和/或，步驟(c)中，所述捕獲探針為雙巰基修飾的捕獲探針；

和/或，步驟(c)中，將捕獲探針與固定液混合，將混合液進樣至工作芯片表面，制得固定有捕獲探針的工作芯片，捕獲探針在混合液中的摩爾濃度為500nM～2000nM；

和/或，步驟(c)中，進樣體積≥10μL；

和/或，步驟(c)中，將工作芯片置入表面等離子共振儀中，以含450mM NaCl、30mMNa₃PO₄.12H₂O、3mM EDTA-2Na、0.25％Triton X-100的緩沖液為運行液。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(b)中，混合液中靶序列T的終濃度≥1.5pM；

和/或，步驟(b)中，孵育時間為15-75min；

和/或，步驟(b)中，孵育溫度為4-48℃；

和/或，步驟(c)中，固定捕獲探針時，固定液選自KH₂PO₄水溶液。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，還包括至少制備一層DNA四面體，并將雜交液、DNA四面體混合反應，將得到的反應液進樣至固定有捕獲探針的工作芯片表面，得到DNA四面體納米分子放大檢測體系。