[發(fā)明專利]一種抗細菌感染魚類模型及其制備方法和用途

有效

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• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN108929879B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 張譯月;張文清;林青;狄乾乾
• 申請（專利權）人: 南方醫(yī)科大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/85;A01K67/027;A61K45/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明提供了一種抗細菌感染魚類模型及其制備方法和用途，具體公開了一種提高魚類抗菌能力的方法，其包括如下步驟：1)克隆npsn基因編碼區(qū)(CDS)，并且將其插入到pTol2載體的熱休克啟動子后，在npsn編碼區(qū)后加入編碼標簽蛋白Myc的序列，構建成pTol2?hsp?Myc?npsn載體；2)將載體通過顯微注射至魚體內并以anti?Myc免疫熒光染色，獲得抗菌能力提高的魚類。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種斑馬魚模型。

背景技術

Npsn(nephrosin)屬于蝦紅素蛋白家族(astacin family)的一員，并且具有肽鏈內切酶活性。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質消化、個體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用。已有的相關研究分析了斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交(Whole-mount In Situ Hybridization,WISH)實驗，發(fā)現了Npsn特異性表達在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，并且可以標記斑馬魚的中性粒細胞。

然而已有的實驗技術僅僅說明了npsn表達在斑馬魚中性粒細胞中，并沒有說明其在中性粒細胞中的作用，本發(fā)明構建npsn基因過表達的穩(wěn)定可遺傳的轉基因品系，這種品系可以增強魚類抗菌能力，顯著提高細菌感染情況下的存活率，對漁業(yè)大規(guī)模養(yǎng)殖預防細菌感染非常有利。

發(fā)明內容

為了解決上述問題，提高魚類抗菌能力，本發(fā)明一個方面提供了一種提高魚類抗菌能力的方法，其包括如下步驟：

1)克隆npsn基因編碼區(qū)(CDS)，并且將其插入到pTol2載體的熱休克啟動子后，在npsn編碼區(qū)后加入編碼標簽蛋白Myc的序列，構建成pTol2-hsp-Myc-npsn載體；

2)將載體通過顯微注射將pTol2-hsp-Myc-npsn載體和轉座酶RNA的混合物注射至單細胞期受精魚卵內，養(yǎng)至成魚，即為F 0代；將F 0代與野生型魚類交配獲得F1代，將獲得的受精卵或胚胎進行熱激處理，并且以anti-Myc抗體染色篩選Myc陽性胚胎保留，即得到F1代具有抗菌能力的魚類；

可選地，所述F1代具有抗菌能力的魚類繼續(xù)進行繁殖獲得經熱激處理后穩(wěn)定具有抗菌能力的魚類；

優(yōu)選地，所述熱激處理為36-42℃處理0.5-2小時，每8-16小時熱激處理一次，共熱激兩次；熱激處理頻率為每周熱激處理兩次。

更優(yōu)選地，所述熱激處理為39℃處理1小時，每12小時熱激一次，熱激處理頻率為每周熱激處理兩次。

本發(fā)明另一個方面提供了一種抗細菌感染的魚類模型的制備方法，其包括如下步驟：

1)克隆npsn基因編碼區(qū)(CDS)，并且將其插入到pTol2載體的熱休克啟動子后，在npsn編碼區(qū)后加入編碼標簽蛋白Myc的序列，構建成pTol2-hsp-Myc-npsn載體；

2)將載體通過顯微注射將pTol2-hsp-Myc-npsn載體和轉座酶RNA的混合物注射至單細胞期受精魚卵內，養(yǎng)至成魚，即為F 0代；將F 0代與野生型魚類交配獲得F1代，將獲得的受精卵或胚胎進行熱激處理，并且以anti-Myc抗體染色篩選Myc陽性胚胎保留并養(yǎng)殖至成魚，即得到抗細菌感染的魚類模型；

可選地，所述F1代具有抗菌能力的魚類繼續(xù)進行繁殖獲得經熱激處理后穩(wěn)定抗細菌感染的魚類模型；

優(yōu)選地，所述熱激處理為36-42℃處理0.5-2小時，每8-16小時熱激處理一次，共熱激兩次；熱激處理頻率為每周熱激處理兩次。

更優(yōu)選地，所述熱激處理為39℃處理1小時，每12小時熱激一次，共熱激兩次，熱激處理頻率為每周熱激處理兩次。

本發(fā)明再一個方面提供了一種npsn過表達魚類的制備方法，其包括如下步驟：