[發明專利]美洲鰣魚雄性生殖細胞的冷凍保存方法

在審

• 申請號: 201710376820.4
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107183006A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 徐紅艷;朱新平;吳栩靈
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司44104
• 代理人: 宣國華,馬赟齋

1.一種美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，包括以下步驟：

（1）對雄性美洲鰣進行酒精殺菌處理，然后取出精巢組織，用磷酸鹽緩沖液沖洗并浸泡精巢組織，裝入試管，冷藏；

（2）棄去所述試管的磷酸鹽緩沖液，在干凈的磷酸鹽緩沖液中剪碎精巢組織，轉移到冷凍保存液后分裝于凍存管中，于程序降溫盒中降溫至-80℃，1-2天后轉移到液氮中冷凍保存。

2.根據權利要求1所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，所述步驟（1）中雄性美洲鰣為性成熟或性未成熟的個體。

3.根據權利要求1所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，所述步驟（1）中酒精滅菌處理時采用體積百分比含量為60~90%的酒精。

4.根據權利要求1所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，所述步驟（2）中冷凍保存液成份：每100mL中含有 5~10mL 二甲基亞砜，胎牛血清30~50mL，高糖DMEM 1.3~1.4g，pH值緩沖劑Hepes 0.4~0.5g。

5.根據權利要求1所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，還包括步驟(3)冷存后復蘇步驟，即從液氮中取出樣品凍存管并迅速轉移到水浴鍋中解凍，離心棄去冷凍保存液，用磷酸鹽緩沖液清洗。

6.根據權利要求5所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，所述解凍溫度30~40℃。

7.根據權利要求5所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，還包括步驟(4)細胞存活率及活力檢測：將復蘇后精巢組織用膠原酶I 28 ℃水浴消化18-25 min，加入胰酶繼續消化18-25 min，使其分離成單個細胞，加入1/10體積牛血清終止消化反應，用細胞篩過濾并收集細胞，采用Hoechst33342和2 μg/mL PI雙染后在熒光顯微鏡下觀察并統計細胞存活率，并結合細胞移植技術對冷凍復蘇組織細胞進行活力檢測。

8.根據權利要求7所述美洲鰣魚雄性生殖細胞冷凍保存方法，其特征是，所述膠原酶I的濃度為0.5~2 mg/mL；所述胰酶的質量百分比含量為0.01~0.5%。