[發(fā)明專利]美洲鰣魚雄性生殖細(xì)胞的冷凍保存方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710376820.4
• 申請(qǐng)日: 2017-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107183006A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐紅艷;朱新平;吳栩靈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司44104
• 代理人: 宣國(guó)華,馬赟齋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生殖細(xì)胞的冷凍保存方法，尤其是涉及美洲鰣雄性生殖細(xì)胞的冷凍保存方法。

背景技術(shù)

魚類生殖細(xì)胞不同于其他體組織細(xì)胞，其攜帶了生物體的遺傳信息并能傳遞到子代，特別是生殖細(xì)胞中的原始生殖細(xì)胞和精原干細(xì)胞都具有一定的細(xì)胞全能性，既能通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或種間細(xì)胞移植技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)外細(xì)胞的增殖，也可進(jìn)一步分化而產(chǎn)生配子，產(chǎn)生后代。因此，生殖細(xì)胞的冷凍保存，一方面是通過(guò)細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行生物種質(zhì)改良的細(xì)胞基礎(chǔ)，另一方面是水產(chǎn)優(yōu)良或珍稀種質(zhì)資源保護(hù)的最直接有效的方法。國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚類精子保存的研究技術(shù)已經(jīng)日趨完善，已分別建立了鯉科魚類、鮭科魚類、斑馬魚、羅非魚、鯛科魚類及鯔魚等淡、海水魚類的精子冷凍保存技術(shù)，并建立了某些淡、海水經(jīng)濟(jì)魚類的冷凍精子庫(kù)。同時(shí)，也有研究進(jìn)行了魚類雄性早期生殖細(xì)胞的冷凍保存，譬如有學(xué)者進(jìn)行了斑馬魚、虹鱒、西伯利亞鱘、細(xì)鱗鮭等魚類生殖細(xì)胞的凍存進(jìn)行了相關(guān)研究。也有學(xué)者對(duì)各種鱘魚的精巢細(xì)胞和草魚性腺細(xì)胞（CO）進(jìn)行冷凍保存。目前，最常見(jiàn)的細(xì)胞凍存方法都是將分離或培養(yǎng)的游離細(xì)胞進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后再直接用于其它實(shí)驗(yàn)；此外精子冷凍保存一般是直接用冷凍劑稀釋精液隨后凍存。而本方法將性腺組織塊直接進(jìn)行冷凍保存，在解凍復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞分離，能得到各時(shí)期的生殖細(xì)胞，包括精原干細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及成熟精子。但是，目前的冷凍保存技術(shù)對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育期有很強(qiáng)的針對(duì)性，用于凍存早期生殖細(xì)胞和精子的冷凍劑、冷凍方法均有較大差異，而且因?yàn)槔鋬鰟┏煞輳?fù)雜，程序繁瑣，生殖細(xì)胞的存活率受多種因素的影響，包括實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)方法的靈敏性等，導(dǎo)致早期生殖細(xì)胞和精子冷凍保存的細(xì)胞存活率都比較低而且重復(fù)性較差。總之，迄今為止，還沒(méi)有能同時(shí)進(jìn)行早期生殖細(xì)胞和精子的長(zhǎng)期冷凍保存的技術(shù)方法。現(xiàn)有的研究報(bào)道表明，成熟精子的保存和早期精母細(xì)胞的保存方法差異極大。然而，物種種質(zhì)資源的保護(hù)研究中，特別是野生資源的采集過(guò)程中，獲得的樣品非常隨機(jī)，性成熟或性未成熟個(gè)體是無(wú)法人為選擇的，如果能研發(fā)一種操作步驟簡(jiǎn)單且能同時(shí)保存精原干細(xì)胞和精子的冷凍保存技術(shù)，將對(duì)物種的資源保護(hù)更具實(shí)踐意義。

美洲鰣是典型的溯河產(chǎn)卵洄游性魚類，其采取一年一次產(chǎn)卵一次繁殖或一年多次產(chǎn)卵繁殖等多種生殖繁育策略。同時(shí)由于美洲鰣的洄游性及溯河產(chǎn)卵的特性，其人工繁殖，特別是高質(zhì)量受精卵的獲得特別難，仍是鰣魚規(guī)模化養(yǎng)殖的瓶頸，也是鰣魚野生資源保護(hù)研究的關(guān)鍵制約因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效的美洲鰣雄性生殖細(xì)胞冷凍保存方法，該方法步驟少、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)，能獲得高成活率的美洲鰣?jiān)缙谏臣?xì)胞至成熟精子等各期雄性生殖細(xì)胞，對(duì)物種資源保護(hù)，包括對(duì)野生資源保護(hù)具有非常重要的實(shí)踐應(yīng)用意義及價(jià)值。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種美洲鰣魚雄性生殖細(xì)胞冷凍保存方法，包括以下步驟：

（1）對(duì)雄性美洲鰣進(jìn)行酒精殺菌處理，然后取出精巢組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗并浸泡精巢組織，裝入試管，冷藏；

（2）棄去所述試管的磷酸鹽緩沖液，在干凈的磷酸鹽緩沖液（PBS）中剪碎精巢組織，轉(zhuǎn)移到冷凍保存液后分裝到凍存管中，于程序降溫盒中降溫至-80℃，1-2天后轉(zhuǎn)移到液氮中冷凍保存。

所述步驟（1）中雄性美洲鰣為性成熟或性未成熟的個(gè)體。

所述步驟（1）中酒精滅菌處理時(shí)優(yōu)選采用體積百分比含量為60~90%的酒精，更佳為70%。

所述步驟（2）中100mL冷凍保存液成份：5~10mL 二甲基亞砜（Dimethyl Sulphoxide， DMSO），胎牛血清30~50mL，高糖DMEM （基礎(chǔ)培養(yǎng)基）1.3~1.4g，pH值緩沖劑Hepes 0.4~0.5g。

進(jìn)一步地，本發(fā)明包括步驟(3)冷存后復(fù)蘇步驟，即從液氮中取出樣品凍存管并迅速轉(zhuǎn)移到水浴鍋中解凍，離心棄去凍存液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗。所述解凍溫度30~40℃，優(yōu)選為37℃。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還包括步驟(4)細(xì)胞存活率及活力檢測(cè)：將復(fù)蘇后精巢組織用膠原酶I 28 ℃水浴消化18-25 min，加入胰酶繼續(xù)消化18-25 min，使其分離成單個(gè)細(xì)胞，加入1/10體積牛血清終止消化反應(yīng)，用細(xì)胞篩過(guò)濾并收集細(xì)胞，采用Hoechst33342和2 μg/mL PI雙染后在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率，并結(jié)合細(xì)胞移植技術(shù)對(duì)冷凍復(fù)蘇組織細(xì)胞，特別是針對(duì)精原干細(xì)胞等早期雄性生殖細(xì)胞，進(jìn)行活力檢測(cè)。