[發(fā)明專利]一種圍產(chǎn)期臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞主細(xì)胞庫的制備方法

在審

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• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN107236702A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張洪鈿;苑春慧
• 申請（專利權(quán)）人: 北京再生生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京紐樂康知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11210
• 代理人: 徐娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞庫的制備方法，具體來說，涉及一種圍產(chǎn)期臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞主細(xì)胞庫的制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是最重要的工程種子細(xì)胞之一，可以體外大規(guī)模培養(yǎng)而不喪失自我更新和多向分化潛能，在藥物研發(fā)、再生醫(yī)學(xué)和組織工程、基因工程等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

2012年，Osiris公司研發(fā)的用于治療兒童急性移植物抗宿主病的PROCHYMAL在加拿大、新西蘭獲得上市批準(zhǔn)，成為干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的標(biāo)志性事件。隨后，Hearticellgram-AMI、Cupistem、Cartistem、 Osteocel、Trinity、LiquidGen等MSCs產(chǎn)品或組織工程產(chǎn)品獲批，細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入成熟期。

近些年來發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期新生兒附屬物，包括胎盤、羊膜、臍帶中含有豐富的MSCs，是最適于建立MSCs生物樣本庫的樣本資源。雖然MSC的分離、培養(yǎng)方法不斷改進(jìn)，但滿足細(xì)胞庫存儲的細(xì)胞得率仍舊不高。我們的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，個體臍帶MSCs存儲的合同約定存儲量為P2代MSCs 1X10⁸。按照靜脈輸入P3代細(xì)胞劑量1X10⁸/療程，大約夠10個療程，無法滿足“干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行)”的內(nèi)部質(zhì)控和質(zhì)量復(fù)核的細(xì)胞量要求，因此目前的MSCs庫依舊是個體化治療庫，無法滿足配型庫制備主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫的細(xì)胞量需求，究其原因主要是原代培養(yǎng)工藝落后導(dǎo)致原代細(xì)胞得率低造成的。

針對相關(guān)技術(shù)中的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容

針對相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種圍產(chǎn)期臍帶源MSCs主細(xì)胞庫的制備方法，能夠提高P0代MSCs得率，滿足配型庫的質(zhì)控細(xì)胞量和移植細(xì)胞量要求。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種圍產(chǎn)期臍帶源間MSCs主細(xì)胞庫的制備方法，包括如下步驟：

S1.將足月剖腹產(chǎn)健康新生兒臍帶進(jìn)行無菌采集；

S2.對產(chǎn)婦進(jìn)行病原微生物篩查，對臍帶樣本進(jìn)行無菌檢測；

S3.將臍帶樣本在生理鹽水中洗凈殘血，用消毒酒精浸泡，再經(jīng)生理鹽水漂洗兩次；

S4.用生理鹽水灌注血管，擠出殘血，將臍帶樣本剪碎成組織塊，用生理鹽水漂洗3次；

S5.將明膠用去離子水溶解，濕熱滅菌,冷卻，緩慢加入2XDMEM（L），水浴搖床混勻；

S6.取組織塊，加入明膠溶液，轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)瓶中平鋪，置于4℃冰箱中過夜后，向培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿凝膠層時收獲；

S7.收獲時以胰蛋白酶消化法收獲細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞篩過濾、離心獲得P0代MSCs，P0代MSCs凍存，記為臍帶源MSCs主細(xì)胞庫。

進(jìn)一步地，所述步驟S1中新生兒臍帶進(jìn)行無菌采集長度為15-20cm，兩端結(jié)扎，所述步驟S3中經(jīng)生理鹽水漂洗兩次后，需要在結(jié)扎處剪斷，棄去兩端。

進(jìn)一步地，所述步驟S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。

進(jìn)一步地，所述步驟S2中產(chǎn)婦經(jīng)病原微生物篩查，應(yīng)無HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，臍帶樣本浸泡在生理鹽水中，采集殘血血樣進(jìn)行無菌檢測，結(jié)果應(yīng)為陰性，進(jìn)行支原體檢測，結(jié)果應(yīng)為陰性。

進(jìn)一步地，所述步驟S5中，所用明膠為24g，以55℃100mL去離子水溶解，116℃條件下濕熱滅菌15分鐘,冷卻至40℃，緩慢加入預(yù)溫至40℃的100mL2XDMEM（L）中，水浴搖床混勻。

進(jìn)一步地，所述DMEM（L）含有4%的Ultroser G serum substitute，所述DMEM（L）中rh b-FGF的濃度為50ng/mL。

進(jìn)一步地，所述步驟S6中，取2cm臍帶樣品的組織塊，加入15ml明膠溶液，攪拌混勻，轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)瓶中平鋪，置于4℃冰箱中過夜后，每個培養(yǎng)瓶中緩慢加入15ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天觀察，每7天換液，至細(xì)胞長滿凝膠層時收獲。